腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的mir--19a表達(dá)與大鼠肺動(dòng)脈高壓形成的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:通過(guò)SD大鼠左肺全切建立肺動(dòng)脈高壓模型，尋找能將mir-19a有效轉(zhuǎn)導(dǎo)入肺動(dòng)脈的方法，研究mir-19a差異性表達(dá)對(duì)大鼠肺血管重建及肺高壓形成程度的影響，明確mir-19a與VEGF、BMPR2的調(diào)控關(guān)系，從而探討出診斷及治療動(dòng)脈型肺動(dòng)脈高壓的潛在靶點(diǎn)及手段。
　　方法:1)建立左側(cè)肺葉全切除肺動(dòng)脈高壓SD大鼠模型，使用腺相關(guān)病毒載體攜帶mir-19a并經(jīng)氣管導(dǎo)管導(dǎo)入大鼠肺動(dòng)脈，第三周行快速冰凍切片，觀察肺動(dòng)脈綠色熒光蛋白表

2、達(dá)(eGFP)，第八周時(shí)行qRT-PCR監(jiān)測(cè)mir-19a含量;2)30只6-8周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為5組，每組6只，C為正常對(duì)照組，行假手術(shù);P0組行單純左側(cè)肺葉全切除手術(shù);P1組行左側(cè)肺葉全切除手術(shù)，并在術(shù)畢時(shí)通過(guò)氣管導(dǎo)管滴入過(guò)表達(dá)mir-19a腺相關(guān)病毒病毒(AAV)，滴度為1*1012v.g./ml;P2組行左側(cè)肺葉全切除手術(shù)，并在術(shù)畢通過(guò)氣管導(dǎo)管注入等量載有mir-19a封閉序列的AAV;P3組行左側(cè)肺葉全切除手術(shù)，并在

3、術(shù)畢通過(guò)氣管導(dǎo)管注入等量的空載AAV。飼養(yǎng)8周后，測(cè)各組平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)，并處死動(dòng)物取肺組織做病理切片HE染色，觀察肺小血管的病理改變，顯微鏡下測(cè)出肺小血管管壁、肺血管直徑，計(jì)算血管管壁厚度與血管直徑的比值(MT％)，判斷肺小血管肌化程度，行BMPR2免疫組化觀察其表達(dá);利用qRT-PCR并檢測(cè)各組肺組織mir-19a、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA表達(dá)，Western-blot測(cè)肺組織內(nèi)的BMPR-2蛋白的表達(dá)。

4、>　　結(jié)果:1)建立了左肺全切肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，表現(xiàn)為第八周的手術(shù)組平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)增高，肌化肺小血管明顯增多，中層平滑肌增厚肥大，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，結(jié)構(gòu)排列紊亂;腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染后3周取肺組織于倒置熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)出現(xiàn)標(biāo)記的增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá);2)手術(shù)組(P0、P1、P2、P3組)平均肺動(dòng)脈壓力、MT％均較C增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在病毒組(P1、P2、P3組)中，相對(duì)P3組，P1組平均肺動(dòng)脈壓

5、力、MT％顯著升高，P2平均肺動(dòng)脈壓力、MT％明顯降低，P1、P2、P3各組間差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);P0、P1、P2、P3組肺動(dòng)脈上BMPRII免疫組化染色均較C組(+++)明顯減弱，其中P1組免幾乎沒(méi)有顯示陽(yáng)性染色(-)，其余各組染色均較弱;對(duì)比C組，VEGFmRNA、mir-19a表達(dá)在P0、P1、P3均有所升高，且P1組較P2、P3有顯著升高，P2較P0、P1、P3明顯降低(P＜0.01);BMPR-2蛋白含量在P0、

6、P1均明顯降低，且P1組減少最顯著，P2較其他組明顯增多。P0、P3中各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)比較后均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:1、通過(guò)呼吸道將6型重組腺相關(guān)病毒(rAAV6)攜帶目的基因轉(zhuǎn)染至大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)，并可使目的基因內(nèi)持續(xù)性、高效表達(dá)，可用于肺動(dòng)脈高壓的靶向治療及相關(guān)肺部疾病的研究。2、大鼠左肺全切模型可以用來(lái)模擬高流量肺動(dòng)脈高壓及全肺切除術(shù)后的病理生理狀態(tài)，并提供研究平臺(tái)。3、miRNA19a可能通過(guò)靶向調(diào)節(jié)BMPR2蛋