高糖或缺氧對原代心肌細胞Nkx2-5、Tbx5表達的影響.pdf

1、目的:心臟是胚胎發(fā)育過程中第一個形成的器官，作為高度特化的器官，一直被認為沒有再生的能力，受損后以瘢痕修復(fù)為主替代之，嚴重影響心肌收縮功能，是不可逆心衰的病理基礎(chǔ)。但在2011年P(guān)orrello等人手術(shù)切除1日齡小鼠15％的心室肌，21天后小鼠心臟完全再生且功能正常無瘢痕形成，證明哺乳動物心肌有再生能力;2013年Senyo等人證實哺乳動物預(yù)先存在的心肌細胞是維持心肌日常更替和受損后心肌再生的主要細胞來源。
　　Nkx2-5與其下

2、游基因Tbx5是心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子，是心肌前體細胞的標志基因，在功能上緊密關(guān)聯(lián)。Nkx2-5、Tbx5隨著心臟發(fā)育成熟表達逐漸降低維持低水平狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)Nkx2-5、Tbx5表達升高與心肌再生相關(guān)。因此Nkx2-5、Tbx5表達升高是參與心肌再生的重要因素。
　　高糖或缺氧是臨床常見心肌受損因素，可導(dǎo)致心肌肥大和心肌纖維化，最終造成心臟功能不可逆損傷。高糖缺氧與損傷之間的關(guān)系認識清楚，但高糖缺氧與心肌再生的關(guān)系沒有明確的認識。

3、高糖或缺氧能否刺激心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、Tbx5表達上調(diào)參與心肌細胞再生未有報道。
　　高糖缺氧均可刺激誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)活性增強，iNOS催化底物可以大量生成一氧化氮(NO)，過量NO和超氧陰離子迅速反應(yīng)生成的過氧亞硝基陰離子(ONOO-)是已知氧化活性最強的一類物質(zhì)，也是體內(nèi)造成氧化應(yīng)激損傷的重要原因。那么，高糖缺氧刺激心肌細胞不同時間后iN

4、OS、Nkx2-5、Tbx5表達如何變化？ONOO-水平是否影響Nkx2-5、Tbx5表達未見報道。
　　通心絡(luò)是國藥準字中藥復(fù)方制劑，是臨床用于治療心臟疾病的常用藥物。不同濃度通心絡(luò)干預(yù)高糖或缺氧刺激的原代心肌細胞是否影響iNOS、Nkx2-5、Tbx5表達未見研究。
　　本實驗旨在探討高糖或缺氧能否使原代心肌細胞Nkx2-5、Tbx5基因表達上調(diào);ONOO-水平是否是影響Nkx2-5、Tbx5表達的重要機制;不同濃度通心

5、絡(luò)的干預(yù)作用。
　　本實驗采用出生3天以內(nèi)SD大鼠乳鼠原代培養(yǎng)心肌細胞。免疫熒光法鑒定心肌細胞。檢測高糖或缺氧刺激原代心肌細胞不同時間iNOS、Nkx2-5、Tbx5基因的表達;不同濃度的通心絡(luò)干預(yù)高糖或缺氧刺激的原代心肌細胞，檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因表達;應(yīng)用ONOO-的供體(SIN-1)和清除劑(FeTTPs)，檢測ONOO-對Nkx2-5、Tbx5基因表達影響。
　　方法:
　　1.原代心肌細胞

6、分離及培養(yǎng)取出生3天以內(nèi)的SD大鼠乳鼠7-8只，75％酒精消毒，用眼科剪在胸骨角上2肋剪開胸腔，輕擠胸腔，擠出心臟，用鑷子取心臟，將取下的心臟剪碎，用胰酶少量多次消化組織塊，采用物理和化學(xué)方法去除成纖維細胞，純化心肌細胞。用含15％胎牛血清的DMEM（低糖）的培養(yǎng)基接種于六孔板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7天用以實驗。
　　2.分組
　　實驗分為高糖組和缺氧組，應(yīng)用25mM的DMEM培養(yǎng)基模擬高糖環(huán)境，應(yīng)用終濃

7、度為100uM的氯化鈷模擬缺氧環(huán)境;
　　(1)檢測細胞在高糖刺激下不同時間iNOS，Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平，將細胞分為正常組（即0h組）、高糖刺激1h、2h、3h、4h、5h組。
　　(2)檢測ONOO-水平對Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細胞分為正常組，高糖組，高糖+鐵卟啉組，SIN-1組。
　　(3)檢測不同濃度通心絡(luò)在高糖刺激下對心肌細胞iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細胞分

8、為高糖組，通心絡(luò)360μg/ml組、通心絡(luò)540μg/ml組、通心絡(luò)720μg/ml組。
　　(4)檢測細胞在缺氧刺激下不同時間iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平，將細胞分為正常組（即0h組），缺氧1h、2h、3h、4h、5h組。
　　(5)檢測ONOO-水平對Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細胞分為正常組，缺氧組，缺氧+鐵卟啉組，SIN-1組。
　　(6)檢測不同濃度通心絡(luò)在缺氧刺激下對心肌細胞iNOS

9、、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的影響，將細胞分為缺氧組，通心絡(luò)360μg/ml組、通心絡(luò)540μg/ml組、通心絡(luò)720μg/ml組。
　　3.形態(tài)學(xué)觀察
　　剛提取的心肌細胞為球形，12小時之后細胞基本貼壁，細胞逐漸伸出偽足，細胞與細胞之間逐漸建立聯(lián)系;48小時細胞逐漸出現(xiàn)跳動，細胞漸漸成片跳動，跳動頻率一致。
　　4.利用免疫熒光的方法檢測提取細胞中cTNT表達，鑒定心肌細胞5心肌細胞通過不同刺激培養(yǎng)后，檢測心肌

10、細胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5的基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　Trizol一步法提取心肌細胞中總RNA;用β-actin做內(nèi)參，RT-PCR方法檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5的mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　1.原代心肌細胞的分離純化及培養(yǎng)采用胰酶消化法，首先將心臟剪碎，胰酶消化心肌組織塊，成功分離為單個心肌細胞;運用差速貼壁法及化學(xué)方法除去成纖維細胞，純化心肌細胞;高糖DMEM培養(yǎng)心肌細胞，相差顯微鏡下觀察剛?cè)〉?/p>

11、心肌細胞為球形、透亮、有立體感，且成活率高、存活時間長，細胞貼壁后逐漸伸出偽足建立細胞之間的聯(lián)系，48小時候細胞出現(xiàn)跳動，并且逐漸成片跳動，頻率一致;利用免疫熒光檢測到心肌細胞中表達心肌細胞特異蛋白cTnT，提示原代心肌細胞培養(yǎng)成功。
　　2.1 心肌細胞在高糖刺激下培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h后檢測心肌細胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.1.1 高糖刺激心肌細胞后iNOS的表達量與0h

12、（0.0198±0.0023）相比，1h(0.1511±0.0078, P＜0.01)、2h(0.2193±0.0300, P＜0.01)、3h(0.1370±0.0079, P＜0.01)、4h(0.0792±0.0106, P＜0.05)、5h(0.1076±0.0102,P＜0.01)均顯著升高;
　　2.1.2 高糖刺激心肌細胞后Nkx2-5的表達量與0h相比，1h(0.0899±0.3012)無差異，2h（5.0721±

13、0.3238，P＜0.01）、3h（3.9528±0.4833，P＜0.01）、4h（3.6183±0.4822，P＜0.01）、5h（3.3206±0.3590，P＜0.01）顯著升高;
　　2.1.3 高糖刺激心肌細胞后Tbx5的表達量與0h相比，1h(2.4470±0.2681，P＜0.01)、2h(6.8240±0.3612, P＜0.01)、3h(3.3203±0.3412, P＜0.01)、4h（3.0649±0.34

14、78，P＜0.01）、5h（2.4626±0.3227，P＜0.01）均顯著升高;
　　2.2 升高或降低ONOO-水平，檢測正常組、高糖組、高糖+鐵卟啉培組，SIN-1組Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌細胞Nkx2-5的表達量與正常組相比，高糖組（7.8980±1.3253，P＜0.01）升高，高糖+鐵卟啉組（3.2280±0.8611）無顯著變化，SIN-1組（6.8

15、342±0.3039，P＜0.01）升高;
　　2.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌細胞Tbx5的表達量與正常組相比，高糖組（5.6467±0.3538，P＜0.01）升高，高糖+鐵卟啉組（1.4675±0.2194）無明顯變化，SIN-1組（5.7920±0.1311，P＜0.01）升高;
　　2.3 心肌細胞在高糖刺激下同時用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心絡(luò)，分別干預(yù)后檢測iNOS、Nkx

16、2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　2.3.1 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細胞iNOS的表達量與對照組（0.1697±0.0128）相比，360μg/ml組（0.1666±0.0318）無明顯變化，540μg/ml組（0.0908±0.0090，P＜0.01）、720μg/ml組（0.1182±0.0140，P＜0.05）顯著降低;
　　2.3.2 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細胞Nkx2-5的表達量與對照組（0.0436±0.

17、0038）相比，360μg/ml組（0.0452±0.0031）無明顯變化，540μg/ml組（0.0255±0.0013，P＜0.01）、720μg/ml組（0.0313±0.0025，P＜0.05）顯著降低;
　　2.3.3 通心絡(luò)干預(yù)高糖刺激的心肌細胞Tbx5的表達量與對照組（0.1287±0.0253）相比，360μg/ml組（0.1087±0.0197）無明顯變化，540μg/ml組（0.0342±0.0040，P＜0.

18、01）、720μg/ml組（0.0481±0.0059，P＜0.05）顯著降低;
　　3.1 心肌細胞在缺氧刺激下培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、4h、5h后檢測心肌細胞中iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.1.1 缺氧刺激心肌細胞后iNOS的表達量與0h（0.0541±0.0071）相比，1h(0.3834±0.0468, P＜0.01)、2h(0.0282±0.0216, P＜0.01)、3h（0.15

19、34±0.0139，P＜0.05）顯著升高，4h（0.0745±0.0154）、5h（0.0679±0.0145）無明顯變化;
　　3.1.2 缺氧刺激心肌細胞后Nkx2-5的表達量與0h（0.0356±0.0050）相比，1h(0.1929±0.0186, P＜0.01)、2h(0.1191±0.0142, P＜0.01)、3h（0.0888±0.0124，P＜0.05）顯著升高，4h（0.0396±0.0063）、5h(0.0

20、328±0.0021)無明顯變化;
　　3.1.3 缺氧刺激心肌細胞后Tbx5的表達量與0h（0.1339±0.0059）相比，1h（0.3750±0.0173，P＜0.01）、2h（0.2353±0.0135，P＜0.01）顯著升高，3h（0.1413±0.0134）、4h（0.1556±0.0055）、5h(0.1767±0.0249)無明顯變化;
　　3.2 升高或降低ONOO-水平，檢測正常組，缺氧組，缺氧+鐵卟啉組

21、，SIN-1組Nkx2-5，Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.2.1 升高或降低ONOO-水平，心肌細胞Nkx2-5的表達量與正常組相比，缺氧組（5.4382±0.4141，P＜0.01）升高，缺氧+鐵卟啉組（1.7654±0.4388）無顯著變化，SIN-1組（5.3441±0.1602，P＜0.01）升高;
　　3.2.2 升高或降低ONOO-水平，心肌細胞Tbx5的表達量與正常組相比，缺氧組（7.4372±0.5549

22、，P＜0.01）升高，缺氧+鐵卟啉組（1.4635±0.1315）無顯著變化，SIN-1組（6.0329±0.3361，P＜0.01）升高;
　　3.3 心肌細胞在缺氧刺激下同時用360μg/ml、540μg/ml、720μg/ml通心絡(luò)，分別干預(yù)后檢測iNOS、Nkx2-5、Tbx5轉(zhuǎn)錄水平的變化。
　　3.3.1 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細胞iNOS的表達量與對照組（0.0263±0.0022）相比，360μg/ml組（

23、0.0271±0.0019）無明顯變化，540μg/ml組（0.0133±0.0010，P＜0.01）、720μg/ml組（0.0112±0.0013，P＜0.01）顯著降低;
　　3.3.2 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細胞Nkx2-5的表達量與對照組（0.0213±0.0013）相比，360μg/ml組（0.0204±0.0019）無明顯變化，540μg/ml組（0.0134±0.0019，P＜0.05）、720μg/ml組（0.

24、0113±0.0017，P＜0.01）顯著降低;
　　3.3.3 通心絡(luò)干預(yù)缺氧刺激的心肌細胞Tbx5的表達量與對照組（0.0333±0.0029）相比，360μg/ml組(0.0310±0.0021)、540μg/ml組（0.0307±0.0025）無明顯變化、720μg/ml組（0.0158±0.0008，P＜0.01）顯著降低;
　　結(jié)論:
　　1.高糖或缺氧可以使原代心肌細胞早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2-5、Tbx5表