聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子、GLP-1和Gastrin在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島樣細(xì)胞中的作用機(jī)制.pdf

1、糖尿病作為一種慢性代謝性疾病嚴(yán)重影響著人們的健康，其主要病因?yàn)橐葝u素分泌相對和（或）絕對不足。胰島移植曾被認(rèn)為是根治糖尿病的有效療法，但因供體來源不足及免疫排斥等限制其在臨床工作中的應(yīng)用。目前非β細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞（insulin-producing cell，IPCs）移植治療糖尿病成為了世界范圍內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是骨髓內(nèi)

2、除造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞。BMSCs多向分化、取材方便、體外易于培養(yǎng)及可自體移植等特性，使其成為誘導(dǎo)分化靶細(xì)胞的首選。
　　在胰島β細(xì)胞分化發(fā)育的過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著至關(guān)重要的作用，其中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子主要包括胰十二指腸同源盒1（pancreatic and duodenal homeobox1，Pdx-1）、神經(jīng)元素3（Neurogenin3，Ngn3）和V型肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源基因A(v-maf muscu-loap

3、oneurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，MafA)等。Pdx-1為胰腺發(fā)育過程中第一個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其作用主要是維持胰腺前體細(xì)胞的發(fā)育，參與胰腺分化發(fā)育的全過程。外源性導(dǎo)入Pdx-1基因不僅可成功誘導(dǎo)BMSCs分化為IPCs，而且可促進(jìn)下游胰島素相關(guān)基因的表達(dá)。Ngn3是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵因子，其控制著胰腺內(nèi)分泌祖細(xì)胞的分化方向，外源表達(dá)的Ngn3可促進(jìn)胰腺導(dǎo)管細(xì)胞向IPCs分化。Maf

4、A是唯一特異存在于胰島β細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能是在Pdx-1基因表達(dá)的前體下反式激活胰島素相關(guān)基因的表達(dá)，參與胰腺β細(xì)胞的形成以及維持胰腺β細(xì)胞的功能。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合后可誘導(dǎo)BMSCs轉(zhuǎn)分化為永久編碼的IPCs。
　　胰島β細(xì)胞的再生和生物功能的維持還需要一些胃腸激素的參與，例如胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和胃泌素（Gastrin）。GLP-1是腸粘膜 L細(xì)胞分泌的胃腸激

5、素，其主要是通過促進(jìn)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄、胰島素的合成和分泌，刺激胰島β細(xì)胞的增殖和分化并抑制其凋亡，進(jìn)而保護(hù)β細(xì)胞并增加β細(xì)胞的數(shù)量。近年來，研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還可以在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為IPCs，然而其作用機(jī)制尚未闡明。胃泌素是人體內(nèi)另外一種重要的胃腸激素，其主要是由消化道黏膜中的G細(xì)胞分泌，研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)糖尿病鼠胰腺組織體積增加以及胰島β細(xì)胞數(shù)量的增加。因此，我們推測GLP-1聯(lián)合胃泌素可進(jìn)一步促進(jìn)IPCs分化，且移植后可降低糖尿病

6、（diabetes mellitus,DM）大鼠的血糖。為此，本實(shí)驗(yàn)開展以下研究。
　　第一部分、大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)及腺病毒載體的構(gòu)建
　　目的：分離、培養(yǎng)、鑒定大鼠BMSCs，構(gòu)建pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體。
　　方法：
　　1.大鼠BMSCs的分離及培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)原代大鼠BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定大鼠BMSCs表面標(biāo)志物CD34、C

7、D44和CD105，CCK-8測定大鼠BMSCs生長曲線。
　　2.腺病毒載體的構(gòu)建: pAd–Cherry、pAd–EGFP、pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry、和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體購買于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司，包裝和擴(kuò)增均在293T細(xì)胞，病毒滴度為10-9-10-10/ml，儲存于-80℃冰箱。
　　結(jié)果：
　　1.原代大鼠BMSCs培養(yǎng)過程中，細(xì)胞逐漸由圓形透亮變成長梭形，符合大鼠 B

8、MSCs形態(tài)特征。流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD34陽性率＜5％，CD44和CD105陽性率＞95%，符合大鼠BMSCs表面標(biāo)志特征。
　　2.生長曲線表明細(xì)胞增殖能力良好。腺病毒載體序列符合基因序列。
　　結(jié)論：
　　1.體外成功分離大鼠BMSCs。
　　2.pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP腺病毒載體構(gòu)建成功。
　　第二部分、體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為IPCs
　　目的：

9、Pdx-1、Ngn3聯(lián)合MafA誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為IPCs，探討GLP-1和Gastrin進(jìn)一步誘導(dǎo)IPCs分化的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1．腺病毒載體感染大鼠BMSCs：pAd–Cherry和pAd–EGFP分別以MOI5-100感染大鼠BMSCs，觀察熒光及細(xì)胞狀態(tài)確定最佳MOI. pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP以最佳MOI單獨(dú)及聯(lián)合感染大鼠BMSCs，培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基。

10、未感染組作為對照組。
　　2.感染后細(xì)胞鑒定及功能檢測（第一階段）：BMSCs分別感染pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry（Pdx-1-Ngn3感染組）、pAd-MafA-EGFP（MafA感染組）、pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP（聯(lián)合感染組），未感染組作為空白對照（未感染組）。蛋白印記（Western blot）檢測感染后細(xì)胞中目的基因的表達(dá)；雙硫腙（DTZ）染色鑒定細(xì)胞分泌胰島素的

11、特性；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測感染后細(xì)胞不同時(shí)期胰島素的分泌情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測感染后細(xì)胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK（葡萄糖激酶）、Glucagon（胰高血糖素）、insulin2（胰島素基因2）mRNA的表達(dá)。
　　3.GLP-1和Gastrin誘導(dǎo)聯(lián)合感染細(xì)胞及功能分析（第二階段）：上述聯(lián)合感染細(xì)胞培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基后7天，分別培養(yǎng)于高糖培養(yǎng)基（聯(lián)合感染組）、高糖培養(yǎng)基

12、含GLP-1（GLP-1誘導(dǎo)組）、Gastrin（Gastrin誘導(dǎo)組）、GLP-1和Gastrin（聯(lián)合誘導(dǎo)組），酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測誘導(dǎo)染后細(xì)胞不同時(shí)期胰島素的分泌情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞Pdx-1、Nestin(巢蛋白)、GK（葡萄糖激酶）、Glucagon（胰高血糖素）、insulin2（胰島素基因2）mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.pAd-Pdx-1-N

13、gn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP單獨(dú)及聯(lián)合感染的最佳MOI分別為50和30。
　　2.第一階段：Western blot顯示各感染組均有相應(yīng)的蛋白表達(dá)，證實(shí)pAd-Pdx-1-Ngn3-Cherry和pAd-MafA-EGFP已成功感染大鼠BMSCs。感染后5天感染組細(xì)胞開始聚集，7天明顯聚集成團(tuán)，且可被DTZ染成猩紅色，證實(shí)此時(shí)細(xì)胞已具備IPCs的特征。ELISA結(jié)果顯示各組均有胰島素分泌，聯(lián)合感染組胰島素的分泌

14、水平明顯優(yōu)于其他組，各組在感染第0、3、5、7、9天胰島素分泌水平逐漸提高，且聯(lián)合感染組升高最為明顯（P＜0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示與未感染組相比，感染組Pdx-1、Insulin2、Glucagon及GK基因表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)；與MafA感染組相比，Pdx-1-Ngn3感染組Pdx-1表達(dá)上調(diào)，聯(lián)合感染組Pdx-1和Insulin2表達(dá)上調(diào)，Glucagon表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)；與Pdx-1-Ngn3感染組相比，聯(lián)

15、合感染組Glucagon表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，聯(lián)合感染組GK、Insulin2 mRNA的表達(dá)明顯優(yōu)于其他誘導(dǎo)組。
　　3.第二階段：ELISA結(jié)果顯示各組均有胰島素分泌，聯(lián)合誘導(dǎo)組胰島素的分泌水平明顯優(yōu)于其他組，各組在誘導(dǎo)第0、3、5、7天胰島素分泌水平逐漸提高，且聯(lián)合誘導(dǎo)組升高最為明顯（P＜0.05）；RT-PCR結(jié)果顯示：與聯(lián)合感染組相比，GLP-1誘導(dǎo)組GK、Insulin2 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05)，聯(lián)

16、合誘導(dǎo)組Pdx-1、GK、Insulin2 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Pdx-1-Ngn3聯(lián)合MafA成功誘導(dǎo)大鼠BMSCs轉(zhuǎn)分化為IPCs。
　　2.GLP-1和Gastrin通過促進(jìn)GK、Pdx-1和insulin2基因的表達(dá)促進(jìn)IPCs的分化及功能的完善。
　　第三部分、IPCs移植治療T1DM大鼠
　　目的：探討IPCs在體內(nèi)對T1DM大鼠體重及血糖變化的影響及機(jī)

17、制。
　　方法：
　　1.T1DM大鼠模型的建立：清潔級SD大鼠，體重220±10g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食12h后，給予腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg。1周后監(jiān)測隨機(jī)血糖，3次隨機(jī)血糖＞16.7mmol/l則造模成功。
　　2.IPCs移植到T1DM大鼠體內(nèi)：采用10%水合氯醛按照0.3ml/100g腹腔注射到大鼠體內(nèi)進(jìn)行麻醉。俯臥位固定大鼠四肢，備皮后左腎區(qū)行長約2cm縱行切口，逐層打開腹腔，將腎臟挑出腹

18、腔，小型鑷子夾起腎臟被膜，微量注射器將制備好的細(xì)胞懸液注射到腎臟下極。25只T1DM大鼠隨機(jī)分成5組，即假手術(shù)組：左腎被膜下移植10ulPBS；移植組A：左腎被膜下移植聯(lián)合感染組細(xì)胞2×106個(gè)；移植組B：左腎被膜下移植Gastrin誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè)；移植組C：左腎被膜下移植GLP-1誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè)；移植組D：左腎被膜下移植聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞2×106個(gè)；另外5只正常大鼠左腎被膜下移植10ulPBS作為正常對照組。
　　

19、3．監(jiān)測大鼠體重及空腹血糖變化：移植后，第7,14,21,28天稱量各組大鼠的體重并記錄，禁食12h后，監(jiān)測各組大鼠空腹血糖水平并記錄。
　　4．腹腔糖耐量試驗(yàn)：移植后28天，各組大鼠禁食12h，按照每公斤體重0.2g50%葡萄糖給予腹腔注射，并監(jiān)測注射前及注射后30min,60min,120min血糖。
　　5．腎臟免疫組織化學(xué)：行腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)后，切除各組大鼠腎臟組織，固定于4%多聚甲醛用于免疫組化檢測。
　　結(jié)果

20、：
　　1．移植后，正常組大鼠體重以每周6-8g增加，而假手術(shù)組大鼠體重以每周3-5g減輕，移植組大鼠體重不但沒有出現(xiàn)明顯的下降，而且有所增加，且以移植組D大鼠體重增加最為顯著。假手術(shù)組大鼠血糖持續(xù)處于高水平，移植組大鼠血糖隨時(shí)間變化均有下降，尤其以移植組D大鼠血糖下降最為明顯。
　　2．腹腔糖耐量試驗(yàn)顯示，正常組大鼠血糖在注射葡萄糖后30min達(dá)高峰，120min時(shí)下降到正常水平；假手術(shù)組大鼠血糖在注射葡萄糖后呈現(xiàn)持續(xù)升高