炎性因子Interleukin-6和新型轉(zhuǎn)錄本環(huán)狀RNA在卵巢衰老中的作用初探.pdf

1、目的：
　　1、探討IL-6在小鼠和人卵巢衰老過程中的表達變化，以及IL-6對小鼠卵泡發(fā)育成熟的影響，初步探究其分子機制。在此基礎(chǔ)上，探索IL-6信號通路抑制劑托珠單抗能否提高年老小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，改善老年小鼠的卵母細胞質(zhì)量，從而為提高高齡婦女的生育結(jié)局提供新的策略和治療方法。
　　2、探索新型轉(zhuǎn)錄本環(huán)狀RNA在女性顆粒細胞中的表達及其在衰老中變化，揭示與卵巢儲備和卵母細胞質(zhì)量下降有關(guān)的環(huán)狀RNA。
　　材

2、料與方法：
　　1、ELISA、免疫化學和蛋白免疫印記分析 IL-6在不同年齡階段小鼠和人卵巢組織中的表達變化；基于卵泡三維培養(yǎng)體系，用不同濃度的IL-6處理小鼠竇前卵泡，觀察IL-6對卵泡直徑增長的影響，化學發(fā)光免疫技術(shù)檢測雌孕激素生成，通過qRT-PCR、免疫熒光、體外成熟以及電鏡評估其對卵母細胞發(fā)育成熟的作用，TUNEL和蛋白免疫印記等檢測凋亡、自噬相關(guān)蛋白和信號分子表達。利用卵巢間質(zhì)細胞與卵泡共培養(yǎng)體系，將托珠單抗加入年老

3、小鼠卵巢間質(zhì)細胞培養(yǎng)基中，觀察其對卵泡發(fā)育成熟的影響；用不同濃度的托珠單抗處理9月齡生殖衰老小鼠，1個月后檢測小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，免疫熒光觀察卵母細胞減數(shù)分裂，MitoTracker檢測卵母細胞線粒體分布，ELISA檢測血清AMH、雌激素和孕酮的水平，蛋白免疫印記技術(shù)檢測凋亡蛋白、自噬相關(guān)蛋白及JAK/STAT3的表達。
　　2、收集2015年1月到2015年8月期間在同濟醫(yī)院生殖中心進行體外受精—胚胎移植患者的顆粒細胞

4、，共126例。通過芯片檢測人顆粒細胞中環(huán)狀RNA表達模式隨年齡的變化，qRT-PCR在20對樣品中驗證差異表達的環(huán)狀RNA。RNase R消化法和Sanger測序鑒定環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性及成環(huán)位點。在另一獨立隊列80例樣品中分析候選環(huán)狀RNA與卵巢儲備標記物和輔助生殖技術(shù)結(jié)局的相關(guān)性，并評估其預(yù)測價值；最后利用生物信息學方法預(yù)測這些候選環(huán)狀RNA參與的生物學過程和信號通路。
　　結(jié)果：
　　1. IL-6在小鼠和人卵巢中的表達

5、隨著增齡而顯著增加，與年齡呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。高濃度的IL-6顯著抑制竇前卵泡的生長和雌孕激素的生成，并降低卵母細胞特異性基因的表達，阻礙卵母細胞減數(shù)分裂能力的恢復。高濃度IL-6處理的卵泡中卵母細胞超微結(jié)構(gòu)嚴重受損，可見受損線粒體的聚集，伴隨ROS生成增加。IL-6對卵泡的負向調(diào)控可能與它激活促凋亡蛋白、降低抗凋亡蛋白、抑制自噬活性有關(guān)。有趣的是，體內(nèi)實驗結(jié)果表明，與老年對照組小鼠相比，IL-6信號通路抑制劑托珠單抗能提高老年小鼠卵巢

6、對促性腺激素的反應(yīng)性增加獲卵數(shù)，降低卵母細胞異常減數(shù)分裂的發(fā)生，改善卵母細胞內(nèi)線粒體集聚，提高年老小鼠血清AMH和雌激素水平。托珠單抗對老年小鼠卵巢的保護作用可能與它抗凋亡和提高自噬活性有關(guān)。
　　2.芯片結(jié)果顯示人顆粒細胞環(huán)狀RNA表達譜在女性衰老進程中發(fā)生顯著改變，而且通過 qRT-PCR確認了 circRNA_103829、circRNA_103827、circRNA_104816和circRNA_101889的表達差異。在

7、校正促排卵方案的影響后，circRNA_103827和circRNA_104816水平仍與女性年齡顯著正相關(guān)。此外，顆粒細胞中這兩個環(huán)狀RNA的表達水平與血清 AMH、 AFC、獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈顯著負相關(guān)關(guān)系。ROC曲線分析表明circRNA_103827和circRNA_104816對臨床妊娠結(jié)局具有一定的預(yù)測價值，其中circRNA_103827用于活產(chǎn)的預(yù)測性能為0.698[0.570-0.825]，靈敏度為77.2％，特異性

8、為60.9％（P=0.006），circRNA_104816的預(yù)測價值為0.645[0.507-0.783]（P=0.043）。生物信息學分析顯示這兩個環(huán)狀RNA可能參與了能量代謝、細胞周期等生物學過程，以及類固醇激素生成、細胞粘附等信號通路。
　　結(jié)論:
　　1. IL-6在人和小鼠卵巢中的表達均呈增齡性的升高，升高的IL-6是竇前卵泡發(fā)育的負向調(diào)節(jié)因子，能引起卵泡發(fā)育成熟障礙和類固醇激素生成受損。它對卵泡發(fā)育成熟的調(diào)控作

9、用可能與促凋亡、抑制自噬活性以及受損線粒體的集聚有關(guān)。此外， IL-6抑制劑托珠單抗注射能提高老年小鼠卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，改善老年小鼠惡化的卵母細胞質(zhì)量。因此，隨年齡增長而升高的IL-6可能是導致女性內(nèi)分泌功能異常、卵母細胞質(zhì)量下降和卵巢低反應(yīng)性的重要因素，阻斷IL-6信號通路有望成為新的提高高齡婦女生育結(jié)局和延長卵巢壽命的方法。
　　2.人顆粒細胞中環(huán)狀 RNA的表達受年齡的影響，隨年齡增長而顯著上調(diào)的circRNA_10