人KIN17在細(xì)胞增殖與衰老中作用的研究.pdf

1、背景與目的：A型核纖層蛋白前體(prelamin A)的結(jié)合蛋白很可能在細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要的作用。人KIN17是本課題組通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出的一個(gè)prelaminA的候選結(jié)合蛋白。KIN17主要與DNA的復(fù)制與細(xì)胞的增殖有關(guān)，并參與了DNA損傷反應(yīng)與修復(fù)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的衰老與DNA損傷修復(fù)功能障礙及基因組不穩(wěn)定性增加有關(guān)。所以我們推測，KIN17很可能在細(xì)胞衰老中發(fā)揮一定的作用。本研究通過確證KIN17與prelamin

2、A的相互作用，檢測KIN17在衰老組織細(xì)胞與正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平與定位情況，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，在細(xì)胞中高表達(dá)KIN17蛋白，探討KIN17對(duì)細(xì)胞增殖與衰老狀況的影響。 方法：用酵母一對(duì)一回復(fù)雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)人KIN17與prelamin A及l(fā)aminA是否存在蛋白間相互作用。構(gòu)建人KIN17原核表達(dá)重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化His-KIN17融合蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)GST-laminA蛋白，為GST-Pull down方法在體外確證

3、KIN17與laminA相互作用做好準(zhǔn)備。免疫組化SP法檢測36例各年齡段人正常皮膚組織標(biāo)本中KIN17的表達(dá)與定位情況；RT-PCR檢測衰老細(xì)胞與正常對(duì)照中KIN17 mRNA的表達(dá)；運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測衰老細(xì)胞與正常對(duì)照中KIN17蛋白的表達(dá)；構(gòu)建pIRES2-EGFP-KIN17真核表達(dá)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染人胚胎腎HEK-293細(xì)胞。MTT方法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長增殖狀況，細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算倍增時(shí)

4、間，檢測細(xì)胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶活性。 結(jié)果：用酵母一對(duì)一回復(fù)雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人KIN17與prelamin A及l(fā)aminA都存在蛋白之間相互作用。成功構(gòu)建了人KIN17原核表達(dá)重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了His-KIN17融合蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)GST-lamin A蛋白，為GST-Pull downassay奠定了基礎(chǔ)。免疫組化結(jié)果顯示KIN17主要在皮膚組織中生長增殖比較活躍的組織細(xì)胞中高表達(dá)。隨著年齡的增長，表皮中表達(dá)KI

5、N17的陽性細(xì)胞比例逐漸下降。而且隨年齡的增長，KIN17的表達(dá)與定位有從細(xì)胞漿向細(xì)胞核中靠攏的趨勢。在25歲以前的青少年階段，人皮膚組織表皮細(xì)胞中的KIN17主要定位于細(xì)胞漿中，26-45歲之間的中青年階段主要集中在細(xì)胞核周邊部位的細(xì)胞漿中，46以后的中老年階段主要定位于細(xì)胞核中。衰老細(xì)胞中KIN17mRNA水平高于正常對(duì)照，但蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照沒有明顯差異。將pIRES2-EGFP-KIN1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞后，MT

6、T方法檢測表明轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長增殖受到抑制，抑制率是27.9％，倍增時(shí)間為54h，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的倍增時(shí)間為38h(P<0.05)。轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-KIN1重組質(zhì)粒后，HEK-293細(xì)胞中β-半乳糖苷酶活性較轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP空載對(duì)照的活性輕度增加(P<0.05)。 結(jié)論：酵母一對(duì)一回復(fù)雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了人KIN17是prelamin A及l(fā)amin A的一個(gè)新的候選結(jié)合蛋白。KIN17主要在人皮膚組織中生長增殖比