尼莫克汀生產(chǎn)菌種的基因改造.pdf

1、尼莫克汀是由藍(lán)灰鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，將其經(jīng)過四步化學(xué)法合成得到的莫西菌素具有高效、廣譜、安全的驅(qū)蟲活性，可廣泛用于農(nóng)藥獸藥領(lǐng)域。為解決現(xiàn)階段尼莫克汀產(chǎn)量偏低，副產(chǎn)物多以及半化學(xué)合成費(fèi)時(shí)費(fèi)力的問題，本文通過基因工程定向改造尼莫克汀生產(chǎn)菌株，為進(jìn)一步優(yōu)化菌種及更高效的工業(yè)化生產(chǎn)提供了思路。
　　首先，利用同源雙交換原理對(duì)尼莫克汀合成基因簇中的甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行同框敲除以阻斷副產(chǎn)物L(fēng)L-F28249γ和LL-F28

2、249λ組份的合成。以pSET152為載體構(gòu)建甲基轉(zhuǎn)移酶nemD基因敲除質(zhì)粒pSET-nemD，通過接合轉(zhuǎn)移將其導(dǎo)入出發(fā)菌株MOX-101中進(jìn)行單、雙交換的篩選，最終成功獲得一株nemD基因缺失型菌株MOX-△nemD149。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證，該菌株不再產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)L-F28249γ和LL-F28249λ組份，且因合成受阻使其前體物質(zhì)尼莫克汀的產(chǎn)量較原始菌株提升約12％。同樣的，以pKC1139為載體構(gòu)建寡霉素類似物基因oli敲除質(zhì)粒pKC1

3、139-oli，對(duì)藍(lán)灰鏈霉菌基因組中長(zhǎng)達(dá)90kb的PKS合成途徑的寡霉素類似物基因簇進(jìn)行整體敲除，利用優(yōu)化的I-SceI酶介導(dǎo)的雙交換篩選方法進(jìn)行雙交換突變株的篩選，最終獲得一株oli基因缺失型菌株MOX-△oli-72。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證，該菌株不再產(chǎn)生寡霉素類似物組份，且其合成前體物質(zhì)流向主產(chǎn)物尼莫克汀合成途徑，使尼莫克汀產(chǎn)量(165mg/l)較出發(fā)菌株MOX-101(119mg/l)提高了39％。
　　其次，構(gòu)建五株含特定點(diǎn)突變序列