博爾納病病毒磷蛋白的原核表達和p24片段熒光定量PCR試劑盒的研制開發(fā).pdf

1、背景及目的:
　　 博爾納病病毒(BDV)是一種嗜神經(jīng)性的單股負(fù)鏈RNA病毒,BDV的感染宿主包括了大部分溫血動物,而根據(jù)一些研究認(rèn)為BDV感染也可能于人類精神疾病有關(guān),在我國和其他國家一些地區(qū)動物、精神疾病患者和腦炎患者中均有散在BDV疑似陽性病例報導(dǎo)。BDV基因組含有6個開放式讀碼框(ORF),其中ORFⅡ編碼磷蛋白(p24),磷蛋白作為抗原參與血清免疫反應(yīng)可以檢測判斷是否有病毒感染存在。此外p24基因由于序列高度保守,并且

2、在檢測同等病毒量時其敏感性要高于核蛋白基因,故p24片段是在BDV核酸檢測上的主要指標(biāo)。
　　 本研究通過原核表達出磷蛋白,并對其進行純化和鑒定,以進一步制備抗體和開發(fā)相關(guān)免疫學(xué)檢測試劑盒。另一方面在套式熒光定量PCR基礎(chǔ)上優(yōu)化適合p24擴增的PCR緩沖液,同時摸索最佳反應(yīng)條件,嘗試開發(fā)BDV p24片段一步法實時熒光定量PCR試劑盒,使之能達到穩(wěn)定可靠而更簡單方便的要求以便可以對樣本進行大規(guī)?？焖俸Y選,通過流行病學(xué)調(diào)查來了解該

3、病毒在我國的分布及流行特征,防治將來可能出現(xiàn)大規(guī)模的暴發(fā)流行,此外在臨床檢驗中可以進一步研究分析BDV和人類神經(jīng)精神疾病的相關(guān)性。
　　 方法:
　　 1通過RT-PCR方法獲得p24基因片段,將目的片段插入到pET-41a原核表達載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌,使用IPTG誘導(dǎo)表達并親和層析純化,對誘導(dǎo)表達的磷蛋白進行SDS-PAGE電泳和Western-Blot分析和鑒定。
　　 2根據(jù)p24片段

4、設(shè)計合成引物和探針,通過常規(guī)PCR比較選擇3種常用酸(鹽酸、磷酸和硫酸)所滴定的緩沖液體系,在其基礎(chǔ)上選擇適合濃度的硫酸銨配制TSS buffer,在TSS buffer中分別加入四甲基氯化銨、Triton X-100、二甲亞砜和甜菜堿這4種常用的PCR添加劑,并確定各自的最佳工作濃度,選擇擴增效果較好的添加劑與其他添加劑進行依次組合,尋找最佳的添加劑組合,最后用熒光定量PCR進行對比驗證。此外在引物的退火溫度、引物和探針的最佳濃度、d

5、NTPs和Mg2+的最佳工作濃度上做出相應(yīng)的優(yōu)化,以求試劑盒的擴增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線達到滿意的效果。
　　 結(jié)果:
　　 1成功構(gòu)建pET41a-p24重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切鑒定和測序后證實序列正確,SDS-PAGE分析目的蛋白表達量占菌體總蛋白30％以上,并且目的蛋白以可溶形式表達,純化后蛋白純度達85%左右,對磷蛋白進行Western-Blot鑒定可見可以與p24單克隆抗體特異性結(jié)合。
　　 2在滴定酸上選擇了效果最好

6、的硫酸,配制TSS buffer硫酸銨的最佳終濃度為6mmol/L。在添加劑的優(yōu)化組合上,1.5mol/L甜菜堿、0.15%Triton X-100、8mmol/L四甲基氯化銨和TSS buffer組合成的TBTT buffer效果最佳,在其與Takara的熱啟動PCR buffer的對比中,TBTT buffer在擴增效率和標(biāo)準(zhǔn)曲線上明顯好于后者,此外退火溫度、dNTPs、Mg2+、引物和探針的最佳工作濃度也得以確定。