PI3K-nos2b參與模擬微重力調(diào)控斑馬魚血管發(fā)育過(guò)程的研究.pdf

1、隨著世界航天事業(yè)的快速發(fā)展，人類在外太空的活動(dòng)周期越來(lái)越長(zhǎng)，近年來(lái)研究顯示，長(zhǎng)期處于微重力環(huán)境下，會(huì)引起宇航員心血管系統(tǒng)局部異常，血管新生及重構(gòu)，導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生。并且微重力可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)而影響心血管系統(tǒng)發(fā)育。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注微重力對(duì)心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響，相繼報(bào)導(dǎo)了一些相關(guān)的信號(hào)調(diào)控途徑，但是微重力究竟是通過(guò)改變哪些關(guān)鍵的分子信號(hào)，影響心血管發(fā)育？還不是很明確，需要更進(jìn)一步闡述。本文采用中科院力學(xué)

2、研究所研制的MG-IIA型地基微重力模擬器，以綠色熒光標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎（Flk1: GFP）作為地面模擬微重力效應(yīng)的研究模型，通過(guò)對(duì)斑馬魚胚胎的旋轉(zhuǎn)進(jìn)行模擬微重力（simulated microgravity, SM）處理，在體實(shí)時(shí)的觀察模擬微重力對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響，并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行初步的探索。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①模擬微重力對(duì)斑馬魚胚胎血管發(fā)育的影響。斑馬魚胚胎受精后12hpf（hour post-

3、fertilization）時(shí)進(jìn)行SM處理，分別處理至24hpf和36hpf，對(duì)照組在1G條件下正常培養(yǎng)，SM組在MG-IIA型地面微重力模擬器中培養(yǎng)。通過(guò)體式顯微鏡統(tǒng)計(jì)斑馬魚胚胎的存活率、心率的情況。熒光拍照、qPCR以及原位雜交實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)照組與SM組斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SM對(duì)斑馬魚的存活率沒(méi)有影響，但是卻顯著降低斑馬魚心率，并且在微重力處理至36hpf時(shí)明顯影響了斑馬魚胚胎的血管發(fā)育，導(dǎo)致局部血管發(fā)育異常，尾部靜脈

4、叢發(fā)育速率加快，促進(jìn)血管新生及重構(gòu)，血管網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜程度提高。說(shuō)明SM會(huì)影響斑馬魚血管發(fā)育過(guò)程。②nos2b參與模擬微重力對(duì)斑馬魚胚胎血管發(fā)育過(guò)程。首先通過(guò)對(duì)SM處理后的36hpf斑馬魚胚胎總蛋白中NO含量的測(cè)定，結(jié)果表明，微重力處理過(guò)后斑馬魚胚胎總蛋白中NO的含量相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)有明顯的增加。初步判斷NO信號(hào)參與到微重力對(duì)斑馬魚胚胎血管發(fā)育過(guò)程。之后再分別注射nos2b MO和注射nos2b MO與微重力共處理，至36hpf觀察血管發(fā)育情

5、況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，nos2b基因被敲降以后，微重力引起的斑馬魚血管新生會(huì)有一定的回救，說(shuō)明nos2b參與到了微重力調(diào)節(jié)斑馬魚血管發(fā)育過(guò)程。③PI3K參與斑馬魚胚胎血管發(fā)育過(guò)程。在實(shí)驗(yàn)中我們采用PI3K的特異性抑制劑LY294002處理斑馬魚胚胎至36hpf，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，用抑制劑處理過(guò)后的斑馬魚胚胎血管發(fā)育情況明顯受到抑制，節(jié)間血管發(fā)育紊亂、尾部靜脈叢有破裂；PI3K參與模擬微重力調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎血管發(fā)育過(guò)程。實(shí)驗(yàn)分為三組，分別

6、為對(duì)照組，模擬微重力至36hpf、模擬微重力至36hpf和LY294002共處理，從表型、qPCR以及全胚原位雜交的結(jié)果中可以看出，用PI3K抑制劑處理過(guò)后，微重力引起血管異常新生作用會(huì)得到部分回救，證明PI3 K確實(shí)參與到了模擬微重力對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的過(guò)程；PI3K-nos2b信號(hào)通路參與模擬微重力調(diào)控斑馬魚血管發(fā)育的過(guò)程。分別注射nos2bmRNA和注射nos2b mRNA與PI3K的特異性抑制劑LY294002共處理，通過(guò)表型、q