甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)低RA苷優(yōu)選單株獲得及相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）因其葉片可提取高甜度（甜度約為蔗糖的250～450倍）、低熱量（熱量?jī)H為蔗糖的1/300）的甜菊糖苷而備受關(guān)注。除了作為甜味劑使用，越來(lái)越多的研究表明甜菊糖苷還具有預(yù)防和治療肥胖癥、糖尿病、高血壓、高血糖以及消炎、抗氧化、抗菌、抗癌和增強(qiáng)免疫力等藥用價(jià)值。甜菊葉片所含甜菊糖苷有多達(dá)30種組分，各種組分因?yàn)檫B接在苷元甜菊醇上的糖基種類和數(shù)量不同，其甜度、味質(zhì)、生物活性等性能迥異。其

2、中甜菊苷(Stevioside，ST)和萊鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)為兩大主要組分，占總糖苷含量的60～80％。ST苷的甜度為蔗糖的250～300倍，略帶苦味，具有藥用價(jià)值;RA苷的甜度為蔗糖的350～450倍，具有更接近蔗糖的甜味。因此為了滿足不同需要，提高單一糖苷組分含量是甜菊育種的目標(biāo)之一。
　　本論文主要包括兩部分研究?jī)?nèi)容:一、通過(guò)對(duì)甜菊雜交后代的篩選獲得一個(gè)ST苷含量較高而RA苷含量近缺失的優(yōu)異單株，

3、并以ST苷向RA苷轉(zhuǎn)化過(guò)程中的關(guān)鍵基因SrUGT76G1為著眼點(diǎn)，從基因和蛋白質(zhì)水平探尋了該單株RA含量極低的原因;二、分別采用RT-PCR半定量和熒光定量PCR的方法分析了甜菊糖苷合成途徑15個(gè)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平和關(guān)鍵基因SrUGT76G1的表達(dá)特性，并通過(guò)SrUGT76G1基因啟動(dòng)子的克隆和序列分析研究了該基因的表達(dá)調(diào)控模式。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)高效液相色譜法對(duì)甜菊品種‘中山3號(hào)’、‘中山4號(hào)’（簡(jiǎn)寫為Z03

4、、Z04）及兩者自然雜交得到的37個(gè)F1代單株進(jìn)行了ST苷和RA苷含量（干葉質(zhì)量比）測(cè)定，結(jié)果表明ST苷含量變化范圍為1.18％～9.83％;RA苷含量變化范圍為5.15％～15.36％;ST苷和RA苷的總含量變化范圍為10.26％～19.67％;RA苷與兩苷總含量比值的變化范圍為34％～90.42％，均近似服從正態(tài)分布。在所測(cè)樣品中，雜交后代單株011的糖苷含量測(cè)定結(jié)果與親本及其他單株差異較大，其ST苷和RA苷的總含量為干葉質(zhì)量的16

5、.29％，ST苷含量為15.9％，而RA苷含量?jī)H0.4％，這在同期測(cè)定的其他甜菊品種及雜交后代等約500個(gè)樣品中也是罕見(jiàn)的。隨后將單株011定名為‘中山5號(hào)’，簡(jiǎn)寫為Z05。
　　2、根據(jù)前人對(duì)甜菊糖苷生物合成途徑的研究，已經(jīng)明確尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶SrUGT76G1催化甜菊醇C-13位C-3'的糖基化，將ST苷轉(zhuǎn)化為RA苷，因此本研究從RA苷含量較高的Z04和低RA苷含量的Z05中分別克隆SrUGT76G1基因，通過(guò)序列比對(duì)

6、分析，探尋Z05葉片ST苷含量較高而RA苷含量近缺失的原因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單株Z05的SrUGT76G1基因DNA序列中存在一個(gè)雜合的無(wú)義突變c.389T＞G(p.L121 X)，同時(shí)在該基因的另一個(gè)拷貝中存在一些導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的堿基替換。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些堿基突變對(duì)酶功能的影響，本試驗(yàn)以Z04和Z05葉片中的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶粗提液進(jìn)行體外酶反應(yīng)，以ST苷標(biāo)準(zhǔn)品為反應(yīng)底物，尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)為糖基供體，以RA苷的產(chǎn)出量為標(biāo)準(zhǔn)，比較

7、Z04和Z05的SrUGT76G1酶活性。液相色譜測(cè)定結(jié)果顯示來(lái)自Z04葉片的酶液反應(yīng)后有RA苷色譜峰出現(xiàn)，而Z05葉片提取的酶液反應(yīng)后沒(méi)有可見(jiàn)的RA苷色譜峰，由此認(rèn)為發(fā)生在Z05 SrUGT76G1基因中的序列突變確實(shí)導(dǎo)致了酶功能的下降。
　　3、為了了解甜菊糖苷合成相關(guān)基因的表達(dá)特性，試驗(yàn)同時(shí)對(duì)甜菊糖苷生物合成途徑中15個(gè)相關(guān)基因進(jìn)行了RT-PCR半定量分析，研究了不同溫度(15℃、25℃、35℃)、水分脅迫、光周期(8L/1

8、6D、10L/14D、14L/10D、16L/8D，L=Light、D=Dark)、和不同生長(zhǎng)階段對(duì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，并對(duì)各處理下甜菊葉片中的甜菊糖苷含量進(jìn)行了HPLC法測(cè)定。15個(gè)甜菊糖苷合成相關(guān)基因的半定量分析結(jié)果表明在25℃處理下各個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平較高;其中基因SrDXS、SrDXR、SrMCT、SrCMK、SrMDS、SrHDS、SrHDR、SrID1、SrGGDPS、SrCPPS1、SrUGT85C2和SrUGT76G1

9、在15℃和35℃處理下轉(zhuǎn)錄受一定程度的抑制;干旱處理抑制了糖苷合成相關(guān)的大部分基因的轉(zhuǎn)錄;不同生長(zhǎng)階段對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平影響較大，在快速生長(zhǎng)期15個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平均相對(duì)較低;基因SrDXS、SrDXR、SrMDS、SrHDR、SrGGDPS、SrKS1-1和SrUGT74G1在現(xiàn)蕾期轉(zhuǎn)錄水平最高;開花期時(shí)SrCMK、SrIDI、SrKO1和SrUGT85C2基因的轉(zhuǎn)錄水平比現(xiàn)蕾期有所增加，在15個(gè)基因中只有SrMCT、SrHDS、SrCP

10、PS1和SrUGT76G1的轉(zhuǎn)錄水平在現(xiàn)蕾期和開花期沒(méi)有顯著差異。糖苷含量測(cè)定結(jié)果表明隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育葉片中糖苷含量逐漸增加，至現(xiàn)蕾期達(dá)到高峰，開花后則下降。
　　4、SrUGT76G1基因相對(duì)表達(dá)量的熒光定量PCR分析結(jié)果表明16小時(shí)的長(zhǎng)日照處理下SrUGT76G1的相對(duì)表達(dá)量是短日照處理下的7.42倍;處于快速生長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾期和開花期的葉片SrUGT76G1相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的0.41倍、0.72倍和82.74倍，可見(jiàn)SrU

11、GT76G1表達(dá)量受光照周期和植株個(gè)體發(fā)育的影響較大。在一天中以4:00所取葉片為對(duì)照，8:00葉片中SrUGT76G1平均相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的1.64倍;12:00時(shí)SrUGT76G1相對(duì)表達(dá)量上升為對(duì)照的1699.75倍;16:00、20:00和24:00時(shí)葉片SrUGT76G1的相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的69.25倍、24.94倍和24.60倍。
　　5、為了進(jìn)一步了解SrUGT76G1基因的表達(dá)調(diào)控模式，本試驗(yàn)采用hiTAIL-

12、PCR的方法克隆到SrUGT76G1翻譯起始位點(diǎn)上游2283 bp的啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE、PLACE等在線工具分析該段序列，發(fā)現(xiàn)有475個(gè)順式調(diào)控元件，除了TATA-box、CAAT-box、MYB結(jié)合位點(diǎn)等保守元件，還有光等環(huán)境因子響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件和組織特異性表達(dá)元件等。通過(guò)克隆SrUGT76G1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1989bp帶酶切位點(diǎn)的序列，將其替換植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220中的CaMV35S啟