系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血中NKT細(xì)胞的變化及意義.pdf

1、前言：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種臨床表現(xiàn)有多系統(tǒng)損害癥狀的慢性系統(tǒng)性自身免疫病，其血清存在抗核抗體、高γ球蛋白血癥、免疫復(fù)合物的形成和補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，具有難治性、易復(fù)發(fā)性、致死率高等特點(diǎn)，其重要臨床特征為多種自身抗體及免疫復(fù)合物形成，B淋巴細(xì)胞高度活化和多種細(xì)胞因子水平異常。
　　 NKT細(xì)胞是在免疫系統(tǒng)中新發(fā)現(xiàn)的一類淋巴細(xì)胞，它是一群獨(dú)立的免疫細(xì)胞，具有特定的細(xì)胞表面標(biāo)志，不同于T、B淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞，是一個(gè)具有自然殺

2、傷細(xì)胞(NK)受體及功能的T細(xì)胞亞群，NKT細(xì)胞不僅表達(dá)T細(xì)胞的表面標(biāo)志，而且表達(dá)NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，并且在不同刺激下分泌大量具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α等，影響免疫反應(yīng)的類型，使免疫反應(yīng)向Th1型或Th2型轉(zhuǎn)換。SLE患者血中細(xì)胞因子的異常變化與T、B淋巴細(xì)胞的過度增殖有關(guān)，Th1/Th2的失衡可能在該病的免疫調(diào)控過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 目前NKT細(xì)胞的研究大部分限于小鼠，人

3、類的NKT細(xì)胞的研究較少，NKT細(xì)胞在免疫反應(yīng)中顯示多方面作用，從目前的研究來(lái)看，此類細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功效超過其效應(yīng)功能，除了凸顯于自身免疫病外，在腫瘤及骨髓移植等實(shí)驗(yàn)中都有同樣的表現(xiàn)。在一系列不同的人類自身免疫疾病中，包括1型糖尿病和多發(fā)性硬化癥發(fā)病的高峰期往往伴有NKT細(xì)胞數(shù)目和活性的降低，提示NKT細(xì)胞的功能低下可使自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能相對(duì)亢進(jìn)而致使發(fā)病機(jī)率增加。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)SLE患者及健康人外周血NKT細(xì)胞的數(shù)量

4、變化的研究進(jìn)一步了解其在發(fā)病中的作用，由于人外周血中NKT細(xì)胞數(shù)量極少，給深入了解NKT細(xì)胞功能帶來(lái)阻礙，本實(shí)驗(yàn)利用NKT細(xì)胞可以被其相應(yīng)配體α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-Galcer)激活的特性，進(jìn)行體外增殖進(jìn)一步研究NKT細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子在SLE發(fā)病中的作用，探討SLE患者NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的類型(Th1/Th2)及作用。
　　 許多研究者發(fā)現(xiàn)SLE患者及動(dòng)物模型體內(nèi)存在著細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)失調(diào)。SLE發(fā)病機(jī)制中Th細(xì)胞亞群

5、失衡的觀點(diǎn)就是根據(jù)細(xì)胞因子譜偏移的現(xiàn)象提出來(lái)的。Th細(xì)胞按其分泌細(xì)胞因子不同而分為Th1和Th2兩亞群，前者分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α，后者分泌IL4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，正常時(shí)兩者維持一定平衡，一旦失衡則可能導(dǎo)致疾病。
　　 對(duì)于NKT細(xì)胞調(diào)節(jié)SLE的作用，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)Va14+NKT細(xì)胞在SLE易感小鼠中隨著年齡增加而逐漸減少，并且NKT細(xì)胞數(shù)量的減少先于疾病的進(jìn)展。而在SLE病人中NKT細(xì)胞的

6、數(shù)量變化及其在該病中所起的作用還不清楚，由此可見，對(duì)SLE患者血中NKT細(xì)胞的研究已成為一個(gè)新的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)、體外應(yīng)用不同干預(yù)因素對(duì)SLE患者NKT細(xì)胞數(shù)量及功能影響的研究，明確不同干預(yù)因素對(duì)NKT細(xì)胞數(shù)量的變化，為SLE患者治療尋求一條新的途徑。
　　 實(shí)驗(yàn)方法
　　 第一部分：選擇SLE患者30例及正常對(duì)照者30例，空腹采集外周靜脈肝素抗凝血，取100μl加入TCRVα-24FITC、TCR Vβ11-PE和

7、CD161-PE各20μl，4℃避光孵育30min，加入紅細(xì)胞裂解液，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SLE及正常對(duì)照者血中NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率。
　　 第二部分：將SLE患者10例及正常對(duì)照者10例，靜脈血中分離的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)一部分培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI-1640中，加入含有GM-CSF，IL-4完全培養(yǎng)液培養(yǎng)5d后，制備并純化DC；另一部分加在12孔培養(yǎng)板中37℃，5％CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)5d，分成4組：對(duì)

8、照組、a-Galcer組、DC組、a-Galcer+DC組，每實(shí)驗(yàn)孔加入1.5×106細(xì)胞，培養(yǎng)14天后收集各組培養(yǎng)板中的細(xì)胞做流式細(xì)胞檢測(cè)。選擇細(xì)胞增殖多的a-Galcer+DC組進(jìn)行NKT純化后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-4，IL-10、IFN-γ和TNF-α的陽(yáng)性比率。
　　 第三部分：選擇SLE患者30例隨機(jī)分為兩組：A組15人，B組15人。分別于用藥前及用藥24h后清晨空腹采集靜脈肝素抗凝血。A組應(yīng)用甲強(qiáng)龍40mg靜脈點(diǎn)滴

9、，B組應(yīng)用甲強(qiáng)龍(40mg)加丙種球蛋白(10g)靜脈點(diǎn)滴，24h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NKT細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)將用藥前靜脈血制備PBMC，A組加甲強(qiáng)龍8ug/ml；B組分兩部分：一部分加甲強(qiáng)龍8ug/ml+丙球2mg/ml，另一部分加細(xì)胞因子IL-12+IL-18各40ng/ml，培養(yǎng)48h后檢測(cè)NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 第一部分：SLE患者外周血Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞顯

10、著低于正常對(duì)照組(p<0.05)，Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞與C3，C4呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.665，r=0.650，r=0.635，r=0.624，P<0.01)，與SLEDIA及ESR呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.678，r=-0.424，r=-0.652，r=-0.433，P<0.01，P<0.05)。
　　 第二部分：以TCRVα24Vβ11標(biāo)記NKT細(xì)胞，擴(kuò)增前，PBMC中Vα24NKT細(xì)胞百分含

11、量較低，僅為(1.01±0.59)％，a-Galcer組、DC組、a-Galcer+DC組分別培養(yǎng)14天后，三組中Vα24NKT細(xì)胞百分含量和細(xì)胞數(shù)均有不同程度的增多，a-Galcer+DC組的擴(kuò)增效果最好，DC組次之，其中，a-Galcer+DC組細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)明顯增加，Vα24+Bβ11+NKT細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的(26.63±11.03)％，較擴(kuò)增前增長(zhǎng)了(13.15×102)倍。
　　 比較三種培養(yǎng)方法后，選擇α-GalC

12、er+DC組培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子，SLE患者外周血Vα24+Vβ11+NKT在佛波酯和離子霉素的強(qiáng)刺激下，Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞能快速分泌大量的IL-4(43.16±22.38)、IL-10(32.12±21.33)、IFN-γ(29.87±18.69)、TNF-α(19.78±10.12)，正常人外周血Vα24+Vβ11+NKT在佛波酯和離子霉素的強(qiáng)刺激下，分泌IL-4(24.10±18.25)，IL-10

13、(24.25±17.36)，和IFN-γ(35.38±14.59)，TNF-α(36.93±18.62)。
　　 第三部分：SLE患者體內(nèi)應(yīng)用甲強(qiáng)龍及甲強(qiáng)龍加丙球24h后Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率明顯高于用藥前(P<0.01)，SLE患者體外制備PBMC后加甲強(qiáng)龍、甲強(qiáng)龍加丙球及IL-12+IL-18進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋

14、巴細(xì)胞比率明顯高于用藥前(P<0.01)；體外應(yīng)用IL-12+IL-18與體外應(yīng)用甲強(qiáng)龍及甲強(qiáng)龍加丙球，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分：SLE患者外周血Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率顯著低于正常對(duì)照組，表明Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞可能參與SLE的發(fā)病過程

15、；
　　 SLE患者Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞與補(bǔ)體C3，C4呈正相關(guān)關(guān)系，與SLEDIA及ESR呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率的減少可能與病情活動(dòng)有關(guān)；CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率顯著低于正常對(duì)照組，表明活化的NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率減少可能與SLE的發(fā)病有關(guān)。
　　 第二部分：α-GalCer，DC組，α-GalCe

16、r+DC組中，α-GalCer-DC組體外Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量最多。
　　 SLE患者Vα24+Vβ11+NKT細(xì)胞分泌IL-4及IL-10陽(yáng)性比率高于IFN-γ和TNF-α，高于健康對(duì)照組(P<0.05)，健康對(duì)照組IFN-γ及TNF-α陽(yáng)性比率高于IL-4及IL-10；說明SLE患者NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以Th2型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子為主，而健康人NKT細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以Th1型細(xì)胞因子為主。
　　

17、 第三部分：體內(nèi)外應(yīng)用甲強(qiáng)龍及甲強(qiáng)龍加丙球后，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率明顯高于用藥前；
　　 體內(nèi)甲強(qiáng)龍及甲強(qiáng)龍加丙球組分別低于相應(yīng)的體外組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是體外實(shí)驗(yàn)偏倚所致；
　　 體外加IL-12+IL-18后與用藥前比，Vα24+Vβ11+NKT，CD161+Vα24+NKT細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比率明顯高于用藥前；與體外應(yīng)用甲強(qiáng)龍及甲強(qiáng)龍加丙球相比，Vα24+Vβ