化合物P7C3--A20在非酒精性脂肪肝中的治療作用及機制.pdf

1、非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關的獲得性代謝應激性肝損傷。包括單純性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關肝硬化1。在美國罹患NAFLD的人群已達到人口總數的30％2，國內流行病學的研究表明，NAFLD已成為我國引起肝功能異常以及慢性肝病的

2、第二大元兇3。
　　煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)又稱為輔酶Ⅰ，是電子傳遞鏈中的ComplexⅠ的重要遞氫物。NAD的合成包括從頭合成途徑(De novo pathway)和補救(Salvage pathway)合成途徑兩條途徑，其中補救合成途徑是維持NAD體內水平的主要途徑。煙酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,NAMPT)是補救合成途徑中的合成限速酶，維持體內NAD

3、的水平4。NAD是生成ATP的必須物質，同時ATP還廣泛參與機體發(fā)育、血管生成、細胞凋亡、組織炎癥、神經退行性病變和腫瘤發(fā)生等病理生理過程5-7。
　　在我們課題組之前關于NAMPT功能方面的研究發(fā)現，NAMPT和NAFLD之間存在重要關聯。NAMPT在NAFLD模型的老年小鼠肝臟中，會隨著年齡增大而表達量逐漸減低，而且NAMPT表達量的降低是老年鼠NAFLD發(fā)病和進展的重要促因8。但NAMPT的相關激活劑能否對NAFLD起到治療

4、作用，以及其治療作用的機制都尚不明確。
　　由于NAMPT是一個酶，因此我們期望能直接找到可以干預其作用的化合物。我們把目光瞄準了P7C3-A20這一化合物。P7C3-A20的CAS號1235481-90-9，屬于氯丙基咔唑類化合物，是latrepirdine（一種神經元保護劑）的同源化合物。前期有報道發(fā)現該化合物可作為“潛在的NAMPT激動劑”升高腦內的NAD水平，發(fā)揮神經保護作用。我們猜測，P7C3-A20很有可能也能在肝臟內

5、發(fā)揮作用，擬分三步對化合物P7C3-A20對NAFLD的治療作用和機制進行了探討。
　　實驗方法:
　　1.將實驗動物分成四組，每組不少于6只，分別為Chow組，Chow+A20組，HFD組和HFD+A20組。Chow組以普通飼料喂養(yǎng)，HFD組以高脂飼料喂養(yǎng)。HFD+A20組在HFD誘導16W后體外腹腔給藥，給藥量20mg/kg/d。給藥2W后，先從體重、代謝率上對小鼠整體代謝水平對NAFLD造模進行評價，然后驗證經過P7C

6、3-A20治療后的小鼠肝臟中是否存在NAD含量水平的改變。
　　2.第二步檢測P7C3-A20對NAFLD各項病理指標及并發(fā)癥進程相關指標的影響。首先檢測血清中的血脂、肝功酶系等指標各組之間的差異，然后再在肝臟組織中檢測氧化應激、炎癥因子、肝臟纖維化標志物、細胞凋亡標志物、胰島素敏感度等指標，檢測P7C3-A20對NAFLD病程進展和并發(fā)癥的治療作用。另外，我們還檢測了另一NAD補充藥物nicotinamide riboside(

7、NR)與SIRT1過表達對NAFLD的治療作用。
　　3.第三步探討P7C3-A20對NAFLD治療作用的機制進行研究，根據實驗結果中發(fā)現P7C3-A20可升高血清FGF1和FGF21的濃度，推測P7C3-A20可能和AMPK/CREB通路激活存在一定的關系。所以對AMPK/CREB在肝細胞中的表達進行檢測，同時檢測磷酸化的標志物phospho-CREB和phospho-AMPK。將AMPKα2+/-小鼠進行雜交配種，制備AMPK

8、α2-/-小鼠。將WT小鼠設置為對照組，AMPKα2-/-小鼠設置為實驗組。兩組小鼠均給予腹腔注射P7C3-A20，3天，20mg/kg/d。取血清檢測血清中FGF1和FGF21的變化，取肝臟檢測AMPK通路相關標志物的表達情況。
　　實驗結果:
　　1.首先HFD組相較于Chow組，可以明確HFD誘導NAFLD模型成功。然后對NAFLD模型小鼠按照Chow組，Chow+A20組，HFD組和HFD+A20組四組分組進行NAD

9、、NADH以及NAD/NADH的檢測，首先驗證P7C3-A20給藥后確實提升對NAD在肝臟中的表達水平。
　　2.HFD組給予P7C3-A20后，相比較于HFD對照組，小鼠減重明顯，代謝率也有所提升;血清中肝功酶系指標有所改善;小鼠肝臟的脂質沉積、氧化應激水平、細胞炎癥水平以及細胞凋亡水平均有所下降;肝臟的纖維化及纖維成分均有所好轉，說明P7C3-A20對NAFLD確實有治療作用。NR、SIRT1過表達對NAFLD也都有治療作用，

10、但是NR比SIRT1過表達作用更為明顯。
　　3.在NAFLD模型小鼠上給予化合物P7C3-A20，可上調血清中兩種重要代謝調控因子FGF1和FGF21的表達。同時P7C3-A20給藥可增加phospho-CREB和phospho-AMPK的表達。同時，此外，P7C3-A20還明顯增加血FGF1和FGF21的濃度。肝臟以及血清中FGF1和FGF21表達明顯提高，相對于對照組野生型小鼠，P7C3-A20在AMPKα2-KO小鼠上對A