老年髖部骨折患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因測序亞群分析.pdf

1、研究背景:
　　髖部骨折是老年人最常見損傷之一，其預(yù)后效果差，老年髖部骨折患者預(yù)后不良與術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高有關(guān)，骨折后1年內(nèi)致殘率超過50％，死亡率高達(dá)36％。目前的治療方案雖然強(qiáng)調(diào)早期手術(shù)固定以及功能康復(fù)鍛煉，但致死率、致殘率仍高居不下。近些年發(fā)現(xiàn)，老年髖部骨折后出現(xiàn)的高致殘率、高死亡率與骨折后機(jī)體出現(xiàn)的免疫炎癥紊亂有著密切的關(guān)系！因此，在外科治療的同時(shí)，糾正老年髖部骨折患者機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)的免疫功能紊亂狀態(tài)，將會(huì)是解決這一問題的關(guān)鍵

2、。而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗炎作用、組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)功能，在許多與免疫炎癥相關(guān)疾病的治療過程中已取得了很大成功，但是對(duì)老年患者創(chuàng)傷后免疫功能調(diào)節(jié)目前尚無相關(guān)報(bào)道。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類高度異質(zhì)性的細(xì)胞群，而以往對(duì)異質(zhì)性的細(xì)胞群體的認(rèn)識(shí)都是停留在群體水平上面。因此，更加系統(tǒng)而全面韻認(rèn)識(shí)和探索各亞群之間的構(gòu)成，找到真正有意義的亞群/亞群比例（與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)系）是十分必要的。近年來，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展為異質(zhì)性細(xì)胞群體在單細(xì)胞水平

3、方面的研究上奠定了重要基礎(chǔ)。
　　研究目的:
　　通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析老年髖部骨折患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的異質(zhì)性，找出不同的亞群，并且分析各個(gè)群的功能;對(duì)于每個(gè)細(xì)胞亞群，將該亞群與其他所有亞群做差異分析比較，獲得每個(gè)亞群差異高表達(dá)的基因，作為亞群的特征基因;在每群特異性表達(dá)的基因里通過數(shù)據(jù)庫分析找到特異性表達(dá)的基因與哪些疾病相關(guān);找到與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的亞群/亞群比例，為后期通過干細(xì)胞治療降低老年髖部骨折患者術(shù)后并發(fā)癥打下

4、堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、選取一例股骨粗隆間骨折需行手術(shù)治療的患者，在術(shù)中擴(kuò)髓過程中用注射器抽取約10ml骨髓，置于無菌袋中立即送入實(shí)驗(yàn)室。
　　2、將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合液進(jìn)行分離、培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80％時(shí)進(jìn)行融合，隨后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，獲取第二代MSCs。
　　3、采用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)對(duì)獲得的第二代MSCs進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂肪方向分化，確定為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　4、對(duì)第

5、二代MSCs進(jìn)行細(xì)胞消化，使細(xì)胞量達(dá)到1000個(gè)/ul，體積100ul，并溶于PBS中，置于無菌袋中送至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單細(xì)胞基因測序及亞群分析。
　　研究結(jié)果:
　　擴(kuò)髓過程中抽取的老年患者骨髓按照一定方法可培養(yǎng)出來骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;培養(yǎng)出來的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在第二代時(shí)細(xì)胞形態(tài)、貼壁性最好;第三代時(shí)即出現(xiàn)增殖不明顯，貼壁性不好;第四代時(shí)細(xì)胞已不再增殖;培養(yǎng)出來的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)為CD90(+)、CD10