基于假病毒系統(tǒng)的三株流感病毒膜蛋白HA-NA重配特性的研究.pdf

1、目的:
　　 本試驗(yàn)在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基礎(chǔ)上，采用構(gòu)建的流感病毒假病毒顆粒，進(jìn)行研究流感病毒不同株型之間膜蛋白HA/NA重配的特性，為新型流感病毒的預(yù)防與抗體研制提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1．三組HA/NA氨基酸序列的比對(duì)
　　 我們通過人工方法對(duì)三組HA/NA氨基酸序列進(jìn)行了對(duì)比，以H3N2HA和H3N2NA為模板進(jìn)行比對(duì)，AHH5N1HA/NA和2009H1N1HA/NA中與之相同的氨基

2、酸序列以“．”代替，并對(duì)比對(duì)序列做以標(biāo)記。
　　 2．質(zhì)粒構(gòu)建
　　 通過酶切、PCR等方法從原始質(zhì)粒上獲取不同株型的流感病毒膜蛋白HAs/NAs的cDNA片段，然后將獲得的不同cDNA片段克隆至pVRC表達(dá)載體形成表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-HA/NAexpressionplasmid)。
　　 3．流感假病毒顆粒的制作
　　 假病毒顆粒的制作是將pVRC-HA/NA表達(dá)質(zhì)粒，Gag-Pol包裝質(zhì)粒(Gag-p

3、olexpressionplasmid)和EGGP報(bào)告質(zhì)粒（Reporterexpressionplasmid）三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞內(nèi)，72小時(shí)后從上清中收取假病毒顆粒（pseudotypedparticle，pp）。
　　 4．假病毒顆粒表達(dá)量的評(píng)價(jià)
　　 于轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞上清中收取假病毒顆粒，用qPCR定量不同重配的假病毒顆粒的拷貝數(shù)。
　　 5．假病毒顆粒感染力的評(píng)價(jià)
　　 過濾的pps

4、按qPCR定量結(jié)果將不同假病毒顆粒調(diào)整至同一拷貝數(shù)水平后進(jìn)行感染試驗(yàn)，感染72小時(shí)后胰酶消化懸浮后通過流式細(xì)胞儀點(diǎn)取GFP表達(dá)的A549細(xì)胞數(shù)量用于假病毒顆粒感染力的評(píng)價(jià)。
　　 6．假病毒顆粒血凝試驗(yàn)
　　 將九種pps根據(jù)qPCR結(jié)果調(diào)整至同一拷貝數(shù)水平進(jìn)行血凝試驗(yàn)。
　　 7．不同流感假病毒顆粒HA/NA蛋白表達(dá)的評(píng)價(jià)
　　 評(píng)價(jià)上清中假病毒顆粒中HA/NA的表達(dá)情況，取同量未調(diào)整的樣品加入4×LD

5、S上樣緩沖液水煮5分鐘后跑SDS-PAGE膠，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上顯色觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1．三組HA/NA氨基酸序列的對(duì)比
　　 在HA的586個(gè)氨基酸序列中，2009H1N1HA有325(55.46％)個(gè)氨基酸序列不同，AHH5N1HA有328(55.97％)個(gè)氨基酸序列不同。2009H1N1HA、H3N2HA、AHH5N1HA三株HA的氨基酸序列中糖基化位點(diǎn)數(shù)分別為6、12、9個(gè)，在190、194、2

6、26處H3N2HA的氨基酸不同于其余兩株，分別被D、I和Q替代。在NA的480人氨基酸序列中，2009H1N1NA和AHH5N1NA分別有260(54.28％)、248(51.77％)個(gè)序列不同。H3N2NA、2009H1N1NA和AHH5N1NA分別含有8、6、3個(gè)糖基化位點(diǎn)，在151序列處H3N2NA的氨基酸被D替代。
　　 2．qPCR結(jié)果
　　 在轉(zhuǎn)染條件一致的情況下，帶有AHH5N1HA的pps在同樣時(shí)間內(nèi)分泌

7、的假病毒顆?？截悢?shù)明顯多于帶有H3N2HA和2009H1N1HA的pps。其中帶有H3N2HA的pps分泌最少。
　　 3．血凝結(jié)果
　　 帶有AHH5N1HA和2009H1N1HA的pps血凝大致相同，而帶有H3N2HA的pps滴度未測出。
　　 4．九種pp感染力
　　 根據(jù)qPCR結(jié)果調(diào)整至同一拷貝數(shù)水平后的九種pps感染力：其中帶有AHH5N1HA的pps感染力明顯高于帶有H3N2HA和2009H

8、1N1HA的pps。其中帶有H3N2HA的pps感染力最低。
　　 5．pps中HA/NA蛋白表達(dá)評(píng)測結(jié)果
　　 在pps中的HA表達(dá)中，2009H1N1HA與AHH5N1HA在分子量和糖基化類型上與各自對(duì)應(yīng)的滅活真病毒十分相似。而在H3組合中，假病毒顆粒的糖基化明顯不同于滅活真病毒(H3N2(W))，并且H3N2HA的分子量明顯大于2009H1N1HA和AHH5N1HA，在138KD和66KD之間，滅活真病毒要比假病毒

9、多出一條帶。在所有假病毒中可以看到HA0都有明顯的表達(dá)，而在AHH5N1HA組合中，HA0的活化類型明顯多于其余兩種HA。
　　 在pps中的NA表達(dá)中，H3N2NA2009H1N1NA與AHH5N1NA在分子量的大小和類型上有明顯的不同，H3N2NA主要表達(dá)為四聚體，三聚體和單聚體，2009H1N1NA主要表達(dá)為單聚體和三聚體，而AHH5N1NA卻主要表達(dá)為單聚體。
　　 結(jié)論:
　　 運(yùn)用假病毒顆粒技術(shù)平臺(tái)，