銅蛋白組在鉛致大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用研究.pdf

1、目的：本研究探討銅蛋白組中銅相關蛋白在鉛致大鼠海馬神經(jīng)損傷中的作用。以其為進一步闡明鉛的神經(jīng)毒性作用機制、從而進行鉛暴露標志物的篩選。本研究結果對鉛中毒進行有效的預防、治療以及早期篩查提供理論依據(jù)。
　　方法：1實驗動物處理及分組：健康雄性SPF級F344大鼠30只，隨機分為對照組和鉛暴露組，采用自由飲水的方式染毒，醋酸鉛組給予0.03％醋酸鉛飲水，對照組給予0.03%醋酸鈉飲水，連續(xù)染毒9周。2應用Morris水迷宮對大鼠進行神

2、經(jīng)行為測試。3應用HE染色法觀察大鼠海馬組織結構變化。4應用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）分析大鼠海馬組織中鉛、銅元素含量。5應用ELISA和試劑盒方法檢測大鼠海馬中晚期糖基化終末產物含量、過氧化氫含量和抑制羥自由基能力。6采用iTRAQ標記技術聯(lián)合液相色譜分離和串聯(lián)質譜鑒定的方法對鉛暴露大鼠模型海馬組織銅差異蛋白質表達進行檢測，并對銅差異表達蛋白進行生物信息學分析。7采用蛋白免疫印跡法對蛋白質組中差異銅相關蛋白CTR1、ATP

3、7A蛋白表達水平進行測定，驗證質譜結果準確性。8應用試劑盒檢測大鼠海馬中銅相關蛋白超氧化物歧化酶Cu/ZnSOD、銅藍蛋白CP的活性。9應用實時熒光定量PCR方法測定海馬組織中銅轉運蛋白（atp7a、atp7b、ctr1、dmt1）、銅伴侶蛋白（atox1、cox17）和銅儲存蛋白（mt1a、mt2a、mt3）等差異銅相關蛋白mRNA表達情況。數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計軟件SPSS17.0分析，計量資料的統(tǒng)計學描述以表x±s示，組間均數(shù)比較用t檢驗，

4、P<0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：1與對照組比較，鉛暴露組大鼠的逃逸潛伏期長，穿臺次數(shù)減少（P＜0.05）。2光鏡下觀察可見，鉛暴露組大鼠海馬神經(jīng)元細胞排列紊亂，大量細胞死亡，表現(xiàn)為細胞核固縮、破裂。3與對照組比較，鉛暴露組大鼠海馬組織鉛含量是對照組大鼠海馬組織鉛含量的3.71倍；鉛暴露組大鼠海馬組織中銅的含量是對照組大鼠海馬組織銅含量的2.87倍。4鉛暴露大鼠海馬組織中過氧化氫和晚期糖基化終末產物的含量均升高，差異有統(tǒng)計學

5、意義（P<0.05）；鉛暴露大鼠海馬組織抑制羥自由基能力比對照組下降了9.75%，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。5鉛暴露大鼠模型海馬組織中共檢測出5166個蛋白質，根據(jù)蛋白的豐度比即差異倍數(shù)大于1.2倍，P值小于0.05等條件篩選，共檢測出鉛暴露組相對對照組共有312個蛋白質有顯著差異。其中，有16個銅差異蛋白上調，有12個銅差異蛋白下調。6蛋白免疫印跡顯示CTR1蛋白的表達顯著升高，而ATP7A蛋白表達水平降低，與質譜鑒定結果一致

6、。7鉛暴露組大鼠海馬組織中Cu/Zn-SOD活性降低了2.73%；CP活性降低了61.08%。8與對照組比較，鉛暴露組海馬組織中銅轉運蛋白atp7a、atp7b、dmt1的mRNA表達下降，ctr1的mRNA表達上升；銅伴侶蛋白atox1、cox17的表達上升；銅儲存蛋白mt1a、mt2a、mt3的mRNA表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：鉛暴露后導致銅在大鼠海馬中蓄積；蛋白質組學技術篩選出鉛暴露大鼠海馬組織