大米過敏原RAG2的基因表達(dá)及其抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、稻米是亞洲國家和一些西方國家的主食。在谷物類蛋白中，大米蛋白質(zhì)量最優(yōu)。然而，在一部分人群中，大米蛋白也可誘發(fā)過敏反應(yīng)。14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑是大米中的主要過敏原。本研究采用基因工程技術(shù)獲得對(duì)應(yīng)14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的重組蛋白R(shí)AG2，并利用重組蛋白制備抗14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的兔多克隆抗體，建立間接競(jìng)爭(zhēng)Elisa法，用于篩選不同的大米品種，期待獲得具有低致敏性的大米品種。

2、研究的主要方法及結(jié)論如下：
　　1.利用基因合成技術(shù)合成14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的基因RAG2，選用pSUMO-Mutant質(zhì)粒載體和大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pLysS作為表達(dá)系統(tǒng)，將基因連接到pSUMO-Mutant載體上，構(gòu)建pSUMO-RAG2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ER2925中進(jìn)行大量克隆擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切分析，顯示合成的RAG2基因序列正確。
　　2. pSUMO

3、-RAG2重組質(zhì)粒在E.coli BL21(DE3)pLysS中成功誘導(dǎo)表達(dá)，追蹤SUMO-RAG2融合蛋白，發(fā)現(xiàn)它是細(xì)胞內(nèi)的不溶性的包涵體表達(dá)；對(duì)包涵體進(jìn)行變性與復(fù)性，并通過Ni柱進(jìn)行親和層析獲得SUMO-RAG2融合蛋白。
　　3.免疫家兔，制備出抗大米過敏原14-16 kDaα-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑的多克隆抗體,其效價(jià)高達(dá)1:320,000。
　　4.收集江西28個(gè)水稻品種，提取鹽溶性蛋白，采用SDS-PAGE電泳和