魚(yú)類(lèi)主要過(guò)敏原小清蛋白的單克隆抗體制備及其金磁酶聯(lián)免疫體系的構(gòu)建.pdf

1、魚(yú)類(lèi)及其制品含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也是FAO及WHO認(rèn)定的導(dǎo)致人類(lèi)過(guò)敏的八大類(lèi)食物之一。其中魚(yú)肉中的小清蛋白（parvalbumin，PV）被視為主要的過(guò)敏原，因此開(kāi)展針對(duì)魚(yú)類(lèi)及其制品中小清蛋白強(qiáng)特異性、高靈敏度的檢測(cè)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本文研究主要包括小清蛋白單克隆抗體的制備及鑒定、金磁復(fù)合納米微粒與酶標(biāo)抗原的制備以及小清蛋白金磁酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　魚(yú)類(lèi)主要過(guò)敏原小清蛋白的制備

2、　　使用硫酸銨分級(jí)沉淀法，從新鮮的鯽魚(yú)魚(yú)肉中提取、純化過(guò)敏原小清蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳表征過(guò)敏原小清蛋白的純度，最后凍干樣品后保存于-20℃冰箱備用。
　　2、小清蛋白單克隆抗體的制備
　　以高純度的PV免疫4只BALB/c小鼠，利用間接ELISA方法測(cè)小鼠抗血清效價(jià)，獲取效價(jià)最高的小鼠（PV效價(jià)為1：256000）。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞。間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔

3、，有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆得到分泌同質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞株。采用小鼠體內(nèi)誘生腹水法大量制備單抗。
　　3、小清蛋白單克隆抗體的鑒定
　　采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化單抗腹水，SDS-PAGE凝膠電泳表征單克隆抗體純度，并采用Western-blotting、考馬斯亮藍(lán)染色法分別檢測(cè)單抗特異性及抗體濃度，結(jié)果顯示 PV單克隆抗體具備良好的特異性，并且單抗?jié)舛葹?00ug/mL，最后通過(guò)商業(yè)化試劑盒檢測(cè)PV單抗亞類(lèi)為IgG1型。

4、　　4、金磁（Fe3O4/Au)復(fù)合微粒與酶標(biāo)抗原的制備
　　采用一鍋法制備氨基化的磁性微粒Fe3O4-PEI，之后在其表面包覆兩層Au顆粒，制備金磁（Fe3O4/Au)復(fù)合微粒，金磁復(fù)合微粒形貌呈圓形，粒徑均一，粒徑約150nm。采用過(guò)碘酸鈉法制備辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記PV，用于后面金磁酶聯(lián)免疫體系的建立。
　　5、金磁酶聯(lián)免疫法檢測(cè)過(guò)敏原小清蛋白體系的建立
　　按照最佳條件制備得到金磁免疫探針和PV酶標(biāo)抗原后

5、，將它們與PV標(biāo)準(zhǔn)溶液競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合建立金磁酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系，初步探究了該體系在魚(yú)類(lèi)及其制品中檢測(cè)小清蛋白的可行性。研究結(jié)果顯示PV濃度5.5-289ng/ml范圍內(nèi)，PV濃度對(duì)數(shù)與抑制率有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=34.96x-6.0357，R2=0.9979；IC50為40.1ng/mL，LOD為2.8ng/mL。此外，對(duì)該檢測(cè)體系進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，包括精密度、特異性、穩(wěn)定性。結(jié)果顯示該方法對(duì)PV檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)在4.3％-9.6%之