蛙皮素樣肽t-BBN介導(dǎo)的金磁納米粒對(duì)乳腺癌MRI-CT靶向成像研究.pdf

1、目的:
　　1.采用兩種不同的方法制備具有多核結(jié)構(gòu)的納米團(tuán)簇，研究不同方法制備出來(lái)的納米團(tuán)簇的理化性能，篩選出一種具有超順磁性、橫向弛豫效能高、粒徑可控且分布均勻的磁性納米材料;
　　2.通過(guò)種子生長(zhǎng)的方法制備出具有不同金殼厚度的Fe3O4@Au納米粒，研究不同金殼層厚度對(duì)納米粒橫向弛豫效能和X線衰減效能的影響，制備出一種適合磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)/X射線計(jì)算機(jī)斷層成像（C

2、omputed tomography, CT）雙模態(tài)成像的對(duì)比劑;
　　3.在Fe3O4@Au納米粒表面偶聯(lián)多肽t-BBN，制備胃泌素釋放肽受體靶向的分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN，研究基于該探針對(duì)乳腺癌進(jìn)行MRI/CT雙模態(tài)成像的可行性。
　　方法:
　　1.具有多核結(jié)構(gòu)磁性納米團(tuán)簇的合成及表征:在惰性氣體的保護(hù)下，以油酸、油胺為表面活性劑，1，2-十六烷二醇為還原劑，在高溫環(huán)境中分解乙酰丙酮鐵得到疏水性F

3、e3O4納米粒，用四甲基氫氧化銨（tetramethylammonium hydroxide，TMAH）對(duì)其進(jìn)行表面改性，使其具有水溶性。用兩親性表面活性劑十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)對(duì)疏水性Fe3O4進(jìn)行表面修飾，使其在水性溶液中自組裝成具有多個(gè)磁性內(nèi)核的膠束結(jié)構(gòu)。同時(shí)，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下，以二乙二醇(diethylene glycol，DEG)為還原劑，F(xiàn)eCl3為前驅(qū)物，通過(guò)高溫水解法一鍋合成

4、具有多個(gè)磁性內(nèi)核的納米簇。對(duì)合成的3種納米粒進(jìn)行理化性質(zhì)表征，包括用透射電子顯微鏡觀測(cè)納米粒的粒徑和形態(tài)、高分辨率透射電鏡觀測(cè)納米粒的晶格條紋、能譜儀和電感耦合等離子發(fā)射光譜儀檢測(cè)納米粒的元素組成、Zeta電位儀測(cè)量納米粒的Zeta電位、動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量納米粒的水合粒徑、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)納米粒的飽和磁化強(qiáng)度（saturation magnetization，Mp）和磁滯回線、MRI掃描檢測(cè)納米粒的橫向弛豫效能(transverse re

5、laxivity，r2)。
　　2.Fe3O4@Au納米粒的合成:通過(guò)Stober法在納米粒表面包覆一層薄薄的SiO2層，然后通過(guò)3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyl triethoxysilane，APTES)的修飾，使納米粒表面帶上氨基基團(tuán)。以硼氫化鈉為還原劑，還原氯金酸溶液得到粒徑為2-3 nm的金種子。通過(guò)金和氨基之間的配位作用將金種納米粒吸附在磁性納米核的表面，然后通過(guò)種子生長(zhǎng)的方法長(zhǎng)成完整的金殼層。通過(guò)加

6、入不同量的生長(zhǎng)溶液得到具有不同金殼厚度的復(fù)合納米粒。對(duì)具有不同金殼層厚度的Fe3O4@Au納米粒進(jìn)行理化性質(zhì)的表征，包括透射電鏡觀察納米粒的形貌、粒徑及化學(xué)成分、UV-Vis測(cè)定不同金殼層厚度復(fù)合納米粒的吸收光譜、Zeta激光粒度儀檢測(cè)納米粒的水化粒徑、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)納米粒的Mp和磁滯回線、CT和MRI掃描檢測(cè)納米粒的納米粒的X線吸收效能和r2。
　　3.Fe3O4@Au-PEG-BBN探針的構(gòu)建及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞T-47D的體

7、外標(biāo)記:參照序列QWAVGHLM合成修飾有巰基化PEG鏈的多肽HS-PEG-t-BBN，利用金與巰基之間的配位作用將多肽分子連接到復(fù)合納米粒的表面，制備出胃泌素釋放肽受體靶向的分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和T47-D為模型細(xì)胞，用CCK-8試劑盒檢測(cè)納米探針的細(xì)胞毒性，通過(guò)普魯士藍(lán)染色和透射電子顯微鏡觀察探針對(duì)T47-D細(xì)胞的特異性標(biāo)記及其在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位。
　　4.Fe3O4@

8、Au-PEG-BBN納米粒對(duì)乳腺癌靶向MRI/CT雙模態(tài)成像研究:用Fe3O4@Au-PEG-BBN探針對(duì)處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的MDA-MB-231和T47D乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行體外標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MR和CT雙模態(tài)成像，體外檢測(cè)納米探針對(duì)T47-D的靶向成像作用。將T47-D和MDA-MB-231兩種細(xì)胞移植到裸鼠皮下，建立人乳腺癌的移植瘤動(dòng)物模型。將探針通過(guò)尾靜脈引入體內(nèi)，取不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)腫瘤進(jìn)行MRI和CT成像，探討探針在體對(duì)人乳腺癌T47

9、-D的靶向成像作用。
　　結(jié)果:
　　1.通過(guò)高溫分解法成功合成疏水性Fe3O4納米粒，納米粒為球形，形貌規(guī)則且粒徑分布很窄，其平均粒徑為7.8±0.8 nm。通過(guò)SDS的表面修飾，納米粒成功自組裝呈具有多個(gè)磁性內(nèi)核的納米膠束，其平均粒徑為145±13 nm。通過(guò)高溫水解一鍋法成功合成Fe3O4納米粒團(tuán)簇，粒徑分布均勻，其平均粒徑為110±10 nm。高分辨電鏡結(jié)果顯示2種納米粒的晶格條紋類(lèi)似，其晶格條紋間距均和Fe3O4標(biāo)

10、準(zhǔn)晶面間距吻合較好，證明合成的2種納米粒均為Fe3O4納米粒。選區(qū)衍射結(jié)果顯示兩者的衍射花樣均呈同心圓樣，且極其相似，通過(guò)衍射環(huán)間距計(jì)算出的納米粒晶面間距和數(shù)據(jù)庫(kù)中Fe3O4的較為吻合。納米粒的能譜分析顯示納米粒中主要含有Fe和O這兩種化學(xué)元素。XRD測(cè)量結(jié)果顯示合成納米粒具有較好的結(jié)晶性，且和Fe3O4的標(biāo)準(zhǔn)X射線衍射譜吻合較好。3種納米粒的水化粒徑依次為9.7±1.2 nm、164±18 nm和123±13nm，在水溶液中均呈負(fù)電性

11、，其Zeta電位依次為-45.2 mV、-52.3 mV和-55.1 mV。測(cè)量3種納米粒的Mp后發(fā)現(xiàn)三者均具有超順磁性，Mp較相近，依次為71 emu g-1、69 emu g-1、65 emu g-1，接近塊體Fe3O4的Mp。但是相對(duì)于單個(gè)Fe3O4納米粒，具有多核結(jié)構(gòu)的磁性納米粒的r2顯著升高，三者的r2分別為67 mM-1S-1、256 mM-1S-1和245 mM-1S-1。
　　2.以高溫水解法合成的納米團(tuán)簇為磁核，

12、成功通過(guò)Stober法在其外表面包被一層SiO2，并進(jìn)行氨基化修飾。合成出粒徑為3.2 nm的金種顆粒，并成功將其偶聯(lián)在磁核表面。依次加入不同量的生長(zhǎng)溶液，得到具有不同金殼成厚度的復(fù)合納米粒。加入10、20和30 mL生長(zhǎng)溶液得到的復(fù)合納米粒的粒徑依次為118±12nm(Fe3O4@Au-10)、125±13nm（Fe3O4@Au-20）和130±11 nm(Fe3O4@Au-30)。UV-Vis吸收光譜測(cè)定顯示不同厚度金殼層的吸收峰的

13、位置不同，3.2 nm金種納米粒的吸收峰在520nm波長(zhǎng)處。隨著加入生長(zhǎng)溶液的增多，復(fù)合納米粒的吸收峰逐漸紅移。隨著金殼層厚度的增加，納米粒的Mp逐漸從63 emu g-1下降到32.5 emu g-1，r2也相應(yīng)地從235 mM-1S-1下降到168 mM-1S-1。相反，隨著金殼層厚度的增加，復(fù)合納米粒的X射線衰減能力逐漸增強(qiáng)，F(xiàn)e3O4@Au-10、Fe3O4@Au-20和Fe3O4@Au-30的X射線衰減能力分別是同濃度碘溶液的

14、1.72、1.91和2.12倍。
　　3.利用金和巰基之間的強(qiáng)配位作用，成功將t-BBN連接在Fe3O4@Au納米粒表面制備出胃泌素釋放肽受體靶向MRI/CT雙模態(tài)探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示Fe3O4@Au-PEG-BBN探針具有較好的生物相容性，未顯著降低細(xì)胞的活性。普魯士藍(lán)染色結(jié)果表明探針能特異性標(biāo)記人乳腺癌細(xì)胞T47-D，其標(biāo)記效率顯著高于MDA-MB-231細(xì)胞組，且探針Fe3O4@Au-

15、PEG-BBN對(duì)T47-D的特異性標(biāo)記作用能被游離的t-BBN多肽阻斷。透射電鏡結(jié)果也證明了探針Fe3O4@Au-PEG-BBN對(duì)T47-D細(xì)胞的特異性標(biāo)記，同時(shí)提示納米探針在細(xì)胞內(nèi)主要分布于細(xì)胞核周?chē)娜苊阁w中。
　　4.體外用系列濃度的Fe3O4@Au-PEG-BBN探針對(duì)T47-D細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MRI和CT成像，結(jié)果顯示隨著濃度的升高，標(biāo)記細(xì)胞的T2信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低。同時(shí)，不同標(biāo)記組細(xì)胞的CT值逐漸升高。采用

16、皮下種植的方法構(gòu)建人乳腺癌動(dòng)物模型，并將探針Fe3O4@Au-PEG-BBN通過(guò)尾靜脈引入到動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行靶向MRI和CT成像。掃描結(jié)果顯示，腫瘤區(qū)域的MRI信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)明顯的降低，且能持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，隨著時(shí)間的推移，腫瘤的信號(hào)強(qiáng)度逐漸回升。興趣區(qū)內(nèi)的CT值同時(shí)出現(xiàn)明顯的上升，其變化規(guī)律和MRI類(lèi)似。
　　結(jié)論:
　　本研究通過(guò)不同的方法成功合成了3種磁性納米粒，篩選出一種同時(shí)具有超順磁性和高r2的磁性納米粒作為復(fù)合納米粒的

17、磁性內(nèi)核。通過(guò)種子生長(zhǎng)的方法在磁性納米粒表面生長(zhǎng)金殼層，并通過(guò)調(diào)整加入生長(zhǎng)溶液的量精確控制了金殼的厚度，制備出一種同時(shí)具有優(yōu)秀r2和X射線衰減效能的MRI/CT雙模態(tài)復(fù)合納米粒Fe3O4@Au?；诮鸷蛶€基之間的強(qiáng)配位作用，成功將t-BBN多肽偶聯(lián)在Fe3O4@Au納米粒表面，構(gòu)建了人乳腺癌T47-D靶向分子探針Fe3O4@Au-PEG-BBN。通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明Fe3O4@Au-PEG-BBN能特異性靶向T47-D細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)人乳腺