多功能納米粒介導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可視化光熱治療與靶向化療.pdf

1、乳腺癌是以淋巴系統(tǒng)作為首要轉(zhuǎn)移途徑，因而有效殺滅或抑制淋巴系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)移腫瘤細胞是乳腺癌預(yù)后的決定性因素之一，對提高乳腺癌的總體生存率具有重要意義。由于乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在腋窩、胸肌間及內(nèi)乳淋巴結(jié)多條轉(zhuǎn)移路徑，且可呈跳躍式轉(zhuǎn)移或微轉(zhuǎn)移，故在傳統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)的過程中難免會遺漏已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，最終導(dǎo)致乳腺癌局部復(fù)發(fā)，影響患者預(yù)后及生存。雖然目前臨床常規(guī)采用新輔助化療，但是這種全身化療方式能進入淋巴系統(tǒng)的藥物量極低，仍然導(dǎo)致部分腫瘤細胞

2、不能得到有效的殺傷。因此，研究者們?nèi)栽趯で笠环N有效的乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療方案。
　　在近年來對腫瘤治療的研究中，光熱治療(photothermal therapy,PTT)是一種新興的治療手段。光熱治療利用激光照射光熱轉(zhuǎn)換材料使局部溫度升高來殺傷腫瘤細胞，相比傳統(tǒng)的放療和化療，光熱治療以其局部精準微創(chuàng)、對正常組織無損傷等優(yōu)勢，在腫瘤治療中受到了越來越多的關(guān)注。光熱治療的關(guān)鍵在于光熱轉(zhuǎn)換材料的性能，一般考慮的因素主要有生物相容性良

3、好、光熱轉(zhuǎn)換效率高、光穩(wěn)定性好。隨著研究的深入，光熱轉(zhuǎn)換材料的設(shè)計也正在向著可視化、多功能化發(fā)展，結(jié)合影像手段實現(xiàn)可視化治療也已經(jīng)成為光熱治療的研究熱點之一。
　　光聲成像技術(shù)是利用光能轉(zhuǎn)化為超聲能的特征，實行體內(nèi)無創(chuàng)性成像的一種新的臨床前技術(shù)，它克服了光學(xué)成像的“軟極限（1mm）”，可以檢測到體內(nèi)深達5cm的病灶，且具有很高的空間分辨率，在探測深度明顯加深的同時能保持較高的對比度。光聲成像與光熱治療相結(jié)合，不僅可以作為可視化手段

4、監(jiān)測光熱轉(zhuǎn)換材料的分布情況，還可以精確定位引導(dǎo)光熱治療，這為乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)光熱治療的精準性提供了重要的依據(jù)。
　　目前乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的臨床治療中，由于患者存在臨床分期和自身情況的差異，傳統(tǒng)、單一的療法往往并不能徹底抑制轉(zhuǎn)移，乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療方法正向著多元化的方向發(fā)展。因此，在結(jié)合影像手段之外，光熱治療應(yīng)進一步結(jié)合靶向化療，從而更有希望徹底解決乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療問題。
　　淋巴結(jié)靶向化療，是利用淋巴系統(tǒng)具有吞噬大

5、分子物質(zhì)的特性，將化療藥物與載體相結(jié)合，經(jīng)局部注射給藥進入淋巴系統(tǒng)，使淋巴系統(tǒng)內(nèi)較長時間保持高濃度的化療藥物，從而有效殺傷淋巴系統(tǒng)內(nèi)的腫瘤細胞，而且藥物不進入血循環(huán)，大大降低了副作用，現(xiàn)己在胃癌、乳腺癌等腫瘤治療中得到了廣泛應(yīng)用。淋巴靶向化療的關(guān)鍵是化療藥物的載體，其應(yīng)具有淋巴結(jié)趨向性、超強吸附能力和定位釋放能力。
　　醫(yī)學(xué)納米材料作為科技前沿技術(shù)之一，在個體化“精準醫(yī)療”呼聲越來越強的時代應(yīng)運而生，近年來，納米材料因其物理、化學(xué)

6、、生物學(xué)方面的獨特性質(zhì)而逐漸成為研究的熱點。因此，我們立足于尋找一種全新的、單體材料固有的，既具有良好的光聲成像特性，又具有高效的光熱轉(zhuǎn)換效率，同時還能攜帶靶向化療藥物的一體化多功能納米材料，以實現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的精準治療，降低局部復(fù)發(fā)率、提高患者生存質(zhì)量。
　　碳納米材料是分散相尺度至少有一維小于100nm的碳材料，具有獨特的光學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)和機械學(xué)等性質(zhì)，近年來碳納米材料在腫瘤光熱治療和藥物傳遞領(lǐng)域的研究層出不窮。納米炭也是

7、一種碳納米材料，具有良好的淋巴結(jié)趨向性和對藥物的高吸附性，已有研究者將其應(yīng)用于乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的靶向化療，但其應(yīng)用于光熱治療尚未見報道。
　　因此，本研究首先比較了在特定波長(808nm)下三種不同結(jié)構(gòu)碳納米材料的光聲效應(yīng)和光熱性能，證明了納米炭具有良好的光聲成像性質(zhì)和光熱轉(zhuǎn)換性能；然后利用可生物降解的高分子材料-乳酸/羥基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)作為成膜材料，制備出包裹

8、納米炭和液態(tài)氟碳(liquid perfluorohexane,PFH)的碳納米粒，在激光輻照下可同時進行光聲顯像和光熱治療；最后利用納米炭的高吸附性，攜載抗腫瘤藥物-多西紫杉醇制備出多功能納米粒，在光聲顯像和光熱治療的基礎(chǔ)上，液態(tài)氟碳產(chǎn)生液-氣相變促使其破裂、藥物定位釋放從而實現(xiàn)靶向化療，以此為乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的影像示蹤、定位引導(dǎo)、聯(lián)合治療提供一種新思路和新方法。
　　第一部分、在特定波長下評價不同結(jié)構(gòu)碳納米材料的光聲效應(yīng)與光熱

9、性能
　　目的：探討不同結(jié)構(gòu)碳納米材料在特定波長下的光聲效應(yīng)與光熱性能。
　　方法：將氧化石墨烯、多壁碳納米管、納米炭配制成不同濃度的混懸液，在808nm波長下用光聲儀觀察其光聲成像效果并測量光聲值，用波長為808nm、不同能量的激光輻照，紅外熱像儀監(jiān)測溫度變化；以金納米棒作為對照，激光輻照30s后關(guān)閉激光，待恢復(fù)至室溫后再次輻照，反復(fù)輻照5次，繪制溫度變化曲線。
　　結(jié)果：三種碳納米材料在808nm波長下均能進行光聲

10、成像和光熱轉(zhuǎn)換，其中多壁碳納米管和納米炭的光聲成像效果和光熱轉(zhuǎn)換能力較氧化石墨烯強，經(jīng)激光輻照后均能使溫度升高至50℃；而且樣品濃度越高、激光能量越強，溫度升高越快。碳納米材料經(jīng)5次輻照后的最高溫度均維持在第一次升高的溫度，而金納米棒經(jīng)5次輻照后溫度僅上升了約10℃。
　　結(jié)論：不同結(jié)構(gòu)碳納米材料在808nm波長下均有不同程度的光聲效應(yīng)與光熱性能，其中多壁碳納米管和納米炭的光聲效應(yīng)與光熱性能較氧化石墨烯強；碳納米材料具有良好的光熱

11、穩(wěn)定性。
　　第二部分、碳納米粒對乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的可視化光熱治療
　　目的：制備一種載納米炭和液態(tài)氟碳的碳納米粒(CNPs)，檢測其物理特性，觀察其光聲效應(yīng)和光熱性能，并探討其在激光輻照下對乳腺癌MDA-MB-231細胞的殺傷作用及對兔VX2腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。
　　方法：采用雙乳化法制備CNPs，光學(xué)顯微鏡、透射電鏡觀察形態(tài)、大小、表面及內(nèi)部，激光粒徑儀檢測粒徑大小及分布，表面電位儀檢測Zeta電位，紫外分光

12、光度法測定上清液和CNPs中納米炭的濃度，計算包封率和載藥量；用波長為808nm的光聲儀觀察其光聲成像效果并測量光聲值；用波長為808nm、不同能量的激光輻照，并用紅外熱像儀觀察溫度變化情況，繪制溫度變化曲線,選擇溫度能維持在約45-50℃的激光能量進行細胞實驗。
　　培養(yǎng)乳腺癌 MDA-MB-231細胞，在培養(yǎng)基中加入載熒光染料的CNPs，6h、12h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察CNPs的細胞吞噬情況；在培養(yǎng)基中加入CNPs，培養(yǎng)

13、12h后予以1.0 W/cm2激光輻照0、1、2、4min，繼續(xù)培養(yǎng)12h后Annexin V/FITC流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
　　建立離體實驗?zāi)Ｐ?，在距離皮下約1.0、2.0、3.0、4.0cm處，用不同能量的激光輻照，通過紅外熱像儀觀察溫度變化情況，繪制溫度變化曲線,選擇溫度能維持在約45-50℃的激光能量進行動物實驗。
　　建立兔VX2腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，分為3組：納米炭組(CNs)、空白納米粒組(NPs)、碳納米

14、粒組(CNPs)，各組分別經(jīng)足底注射納米炭、空白納米粒、碳納米粒，24h后光聲儀觀察其在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的分布情況，808nm、1.5W/cm2激光輻照，紅外熱像儀觀察局部溫度變化情況。各組于治療前及治療4w后經(jīng)二維超聲成像測量淋巴結(jié)大小并計算體積、彩色多普勒血流成像觀察血流多少并分級，彈性成像觀察軟硬程度并測量彈性值；治療4w后取出淋巴結(jié)，HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移及細胞壞死情況，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)，免疫組化法觀察Ki-67、

15、CD44v6、E-Cadherin的表達水平。
　　結(jié)果：本研究制備的CNPs外觀呈黑色乳液，光鏡和電鏡下觀察呈球形，大小均一，表面光滑，分散均勻；激光粒徑儀測得其平均粒徑大小為(452.7±23.6)nm，表面電位儀測得其Zeta電位為-(20.8±1.6)mV；紫外分光光度法測定上清液和CNPs中納米炭的濃度，分別得到的包封率為(51.98±2.86)%、(52.50±3.22)%，載藥量分別為(2.95±0.12)%、(2.

16、83±0.16)%；其光聲成像效果良好，光聲值為6.92±1.45；其光熱轉(zhuǎn)換效率高，在1.0W/cm2的激光輻照下溫度迅速升高并維持在約45-50℃。
　　激光共聚焦顯微鏡觀察到，CNPs能夠被乳腺癌MDA-MB-231細胞吞噬，且具有時間依賴性。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，CNPs經(jīng)激光輻照后可對乳腺癌細胞產(chǎn)生殺傷作用，且輻照時間越長、殺傷作用越大。
　　離體實驗表明，CNPs與體表的距離對其光熱轉(zhuǎn)換效率影響較大，≤2.0c

17、m CNPs的光熱轉(zhuǎn)換效率高，在1.5W/cm2的激光輻照下溫度迅速升高并維持在約45-50℃，＞2.0cm其光熱轉(zhuǎn)換效率明顯降低。
　　CNPs能夠?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行光聲顯像并經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有一定的治療作用，治療4w后NPs組的淋巴結(jié)體積較治療前增大，CNs組和CNPs組的淋巴結(jié)體積較治療前略減小，但血流明顯減少且彈性值減低；HE染色觀察到CNs組和CNPs組的淋巴結(jié)內(nèi)有較多細胞壞死，但部分淋巴結(jié)內(nèi)仍可見殘余腫瘤

18、細胞；TUNEL法顯示CNs組和CNPs組的細胞凋亡指數(shù)較NPs組高；免疫組化顯示CNs組和CNPs組的壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色，存活腫瘤細胞Ki-67呈低表達、CD44v6呈陰性表達、E-Cadherin呈陽性表達，而NPs組的腫瘤細胞Ki-67呈高表達，CD44v6呈陽性表達，E-Cadherin呈陰性表達。
　　結(jié)論：雙乳化法能成功制備CNPs，其體外的光聲效應(yīng)和光熱性能良好，經(jīng)激光輻照后對乳腺癌MDA-MB-231細

19、胞有明顯的殺傷作用，其體內(nèi)的光聲效應(yīng)亦良好，經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有一定的治療作用，但其光熱轉(zhuǎn)換效率隨距離的增大有所下降。
　　第三部分、多功能納米粒對乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)可視化光熱治療與靶向化療
　　目的：制備一種多功能納米粒(DOC-CNPs)，檢測其物理特性，觀察其光聲成像效果、光熱轉(zhuǎn)換性能和藥物釋放能力，并探討其在激光輻照下對乳腺癌MDA-MB-231細胞的殺傷作用及對兔VX2腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。
　　

20、方法：采用雙乳化法制備 DOC-CNPs，光學(xué)顯微鏡、透射電鏡觀察形態(tài)、大小、表面及內(nèi)部，激光粒徑儀檢測粒徑大小及分布，表面電位儀檢測Zeta電位，光聲儀觀察其光聲成像效果；激光輻照并用紅外熱像儀觀察溫度變化情況；高效液相色譜法測定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的濃度，計算包封率和載藥量；將DOC-CNPs裝入透析袋中，用1.0W/cm2的激光輻照后，于不同時間點取樣，高效液相色譜法測定多西紫杉醇的濃度，計算各時間點累積釋放率，繪

21、制藥物釋放時間曲線。
　　培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細胞，將細胞分為4組：對照組(CT)、DOC-CNPs組(DC)、激光輻照組(LA)、DOC-CNPs與激光輻照組(DC＋LA)，CT組不予任何處理，DC組、DC＋LA組加入DOC-CNPs，LA組、DC＋LA組予以1.0W/cm2激光輻照4min，各組細胞處理后經(jīng)Annexin V/FITC流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。
　　建立兔VX2腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，同樣分為4組：

22、CT組不予任何處理，DC組、DC＋LA組經(jīng)足墊注射DOC-CNPs，24h后用光聲儀觀察 DOC-CNPs在腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的分布情況，LA組、DC＋LA組每天予以1.5W/cm2激光輻照10min。各組于治療前及治療4w后經(jīng)超聲成像監(jiān)測淋巴結(jié)的大小、血流及硬度；治療4w后取出淋巴結(jié)，HE染色觀察腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及壞死情況，TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡指數(shù)，免疫組化法觀察Ki-67、CD44v6、E-Cadherin的表達水平。
　　

23、結(jié)果：本研究制備的 DOC-CNPs外觀呈黑色乳液，光鏡和電鏡下觀察呈球形，大小均一，表面光滑，分散均勻；激光粒徑儀測得其平均粒徑大小為(463.7±25.2)nm，表面電位儀測得其 Zeta電位為-(22.6±1.2)mV，且其光聲成像效果良好、光熱轉(zhuǎn)換效率高；高效液相色譜法測定上清液和DOC-CNPs中多西紫杉醇的濃度，計算得到的包封率分別為(63.85±2.41)%、(64.16±1.87)%，載藥量分別為(10.08±0.39)

24、%、(9.83±0.42)%；經(jīng)1.0W/cm2的激光輻照后DOC-CNPs的藥物累積釋放率隨時間延長不斷升高，而對照組較低。
　　流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，DC＋LA組細胞凋亡率明顯高于其余各組。
　　DOC-CNPs能夠?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)進行光聲顯像并經(jīng)激光輻照后對腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)有良好的治療作用，治療4w后CT組、LA組的淋巴結(jié)體積較治療前增大，DC＋LA組的淋巴結(jié)體積較治療前明顯減小，且血流信號明顯減少、彈性值明顯減低；H

25、E染色觀察到DC＋LA組的淋巴結(jié)內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤細胞壞死，DC組可見部分腫瘤細胞壞死；TUNEL法顯示DC＋LA組的細胞凋亡指數(shù)較其余各組高；免疫組化顯示CT組和LA組腫瘤細胞Ki-67呈高表達，CD44v6呈陽性表達，E-Cadherin呈陰性表達，DC組可見部分壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色，而DC＋LA組大量壞死腫瘤細胞呈均質(zhì)的棕黃色染色。
　　結(jié)論：雙乳化法能成功制備DOC-CNPs，其光聲效應(yīng)、光熱性能和載藥能力良好，經(jīng)激