人體胃腸道微生態(tài)消化模擬系統(tǒng)的構(gòu)建及其穩(wěn)定性評估.pdf

1、近年來，人們對食品安全以及營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等問題日益關(guān)注，人體體外消化模型在食品營養(yǎng)吸收、藥物代謝、污染物生物可及性分析以及食品攝入安全評價等方面的應(yīng)用越來越受到重視，但現(xiàn)有的人體體外消化模型大部分局限于胃和小腸、以及小鼠、大鼠等動物模型，不能從本質(zhì)上模擬人體胃腸道微生態(tài)，也存在飼養(yǎng)成本高、繁殖率低、生命周期長以及倫理道德等問題。因此建立和發(fā)展一套靈活的、精確的、可重復操作的并且適應(yīng)東方人飲食習慣的人體胃腸道微生態(tài)消化模擬系統(tǒng)用于營養(yǎng)

2、學、毒理學、微生物學等領(lǐng)域成為新的研究方向。本論文涉及一種人體胃腸道微生態(tài)消化體外模擬系統(tǒng)（SmartGut。SG）的構(gòu)建，并對該系統(tǒng)穩(wěn)定性進行了可行性評估，具體工作如下：
　　1. SG系統(tǒng)的開發(fā)與設(shè)計。SG系統(tǒng)模型的建立是基于比利時根特大學人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)模擬裝置（SHIME）設(shè)計原理，結(jié)合東方人生活習性進行改進來達到在體外條件重現(xiàn)人體胃腸道系統(tǒng)。SG系統(tǒng)模型主要包括5罐3階段—模擬人類的胃、小腸和大腸，包括：系統(tǒng)控制器、模

3、擬消化系統(tǒng)、攪拌系統(tǒng)、時間控制系統(tǒng)、速率控制系統(tǒng)、氣路控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)、pH反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)、料液試劑瓶、消化液試劑瓶、酸堿液試劑瓶，廢液收集器。
　　2. SG系統(tǒng)模擬實驗方法的建立。模擬實驗方法主要包括：系統(tǒng)各階段運行時間、物料蠕動速度及其他參數(shù)設(shè)定，糞便接種液制備，腸道微生態(tài)的增值和穩(wěn)定，胃和小腸消化液、營養(yǎng)液制備，消化模擬以及各項穩(wěn)定參數(shù)的測定等步驟。
　　3. SG系統(tǒng)穩(wěn)定性的可行性評估。主要包括4部分系統(tǒng)參數(shù)的

4、測試與評估，具體結(jié)果如下：
　　（1）采用2名年齡在20~35歲且半年內(nèi)未服用抗生素藥物的健康寄主的糞便分別進行剪切和渦旋兩種不同方法的制備糞便接種液并置于-80℃冰箱儲存。利用細菌培養(yǎng)技術(shù)和變性凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)對接種液儲存周期內(nèi)的微生態(tài)結(jié)構(gòu)的變化進行評估，結(jié)果顯示第3、6、12、18、24天時接種液中乳酸桿菌、總厭氧菌和總好氧菌的數(shù)量以及DGGE指紋圖譜結(jié)構(gòu)與第0天對照無明顯變化，推測本實驗制備的糞便接種液在-8

5、0℃儲存過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)，Ⅰ號受試者糞便中微生物的富集程度高，更適合于SG系統(tǒng)的糞便接種液制備，且利用剪切法制備的糞便接種液更適合于SG系統(tǒng)。
　?。?）對SG系統(tǒng)運行周期內(nèi)升結(jié)腸罐、橫結(jié)腸罐、降結(jié)腸罐發(fā)酵液樣品中乳酸菌、大腸桿菌、總好氧菌的數(shù)量進行測定。SG系統(tǒng)運行周期的前5天，乳酸菌、大腸桿菌、總好氧菌的數(shù)量在升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸內(nèi)波動變化，其中乳酸菌的數(shù)量在波動期內(nèi)呈上升趨勢，而大腸桿菌以及總好氧菌的數(shù)量呈明顯下降趨勢，

6、從第7天開始進入穩(wěn)定期，各個菌種的數(shù)量在大腸的各個階段中維持穩(wěn)定狀態(tài)，推測SG系統(tǒng)在加入糞便接種液的前5天為波動期，從第7天開始進入穩(wěn)定期。
　?。?）采用PCR-DGGE技術(shù)，對SG系統(tǒng)運行周期內(nèi)每天6:00和12:00兩個時段升結(jié)腸、橫結(jié)腸以及降結(jié)腸發(fā)酵液中的細菌多態(tài)性進行分析，得到以下結(jié)論：SG系統(tǒng)在其運行周期內(nèi)，第1天系統(tǒng)內(nèi)細菌菌落的種類和數(shù)量最少，微生物處于對新的生長環(huán)境的適應(yīng)期，從第2天開始細菌的種類和數(shù)量明顯增多，微

7、生物的生長處于對數(shù)增長期，并從7天左右進入穩(wěn)定期，且進入穩(wěn)定期后SG系統(tǒng)中細菌菌落的種類和數(shù)量基本相同，微生態(tài)結(jié)構(gòu)最為穩(wěn)定；SG系統(tǒng)在6:00和12:00兩個時段的細菌多態(tài)性差別并不明顯，證明系統(tǒng)在達到穩(wěn)定后，進食時間對系統(tǒng)微生態(tài)結(jié)構(gòu)的變化幾乎無影響；在系統(tǒng)的3個不同大腸階段，降結(jié)腸中細菌菌落的種類和數(shù)量最多，橫結(jié)腸次之，升結(jié)腸中相比最少。
　　（4）采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測（GC-FID）技術(shù)，對SG系統(tǒng)升結(jié)腸、橫結(jié)腸以及

8、降結(jié)腸發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸含量進行分析，得以下結(jié)論：
　　SG系統(tǒng)中微生態(tài)在系統(tǒng)運行過程中代謝產(chǎn)生短鏈脂肪酸，主要有乙酸、丙酸、丁酸以及戊酸。代謝產(chǎn)生的乙酸最高值為86.40μg/mL，其次是丙酸和丁酸，戊酸的含量是最低為10.21μg/mL，
　　SG系統(tǒng)在系統(tǒng)運行周期內(nèi)，前期總SCFA和各短鏈脂肪酸的含量保持總體上升趨勢且有較大的波動，從第7天開始總SCFA和各短鏈脂肪酸的含量基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，在一定范圍內(nèi)稍許波動。推測

9、是由于系統(tǒng)運行前期系統(tǒng)各消化階段的微生態(tài)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，短鏈脂肪酸的含量隨著微生物種類和數(shù)量的增多而增加，但當系統(tǒng)進入穩(wěn)定期后，各消化階段的微生態(tài)結(jié)構(gòu)也趨于穩(wěn)定，降結(jié)腸中菌群的數(shù)量和種類最多，微生態(tài)結(jié)構(gòu)也最為復雜，因此對于生長環(huán)境中各種營養(yǎng)物質(zhì)的需求量也必然大，當生長環(huán)境中的營養(yǎng)成分不足已維持降結(jié)腸中微生物正常的生理代謝時，就會開始消耗微生物自身代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，因此在系統(tǒng)進入穩(wěn)定期后降結(jié)腸中的總SCFA的含量反而小于升結(jié)腸和橫結(jié)腸的含

10、量。
　　升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸分別在不同一時刻（6:00和12:00）總SCFA和各短鏈脂肪酸的含量呈現(xiàn)一定的規(guī)律：12:00升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸中總SCFA和各短鏈脂肪酸的含量明顯高于6:00，推測是由于系統(tǒng)的腸道微生態(tài)經(jīng)過一夜的無進食發(fā)酵已開始消耗微生物自身代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，因此早上6:00時系統(tǒng)中總SCFA和各短鏈脂肪酸的含量要比12:00時低。
　　本研究涉及到的人體胃腸道微生態(tài)消化模擬系統(tǒng)（SG）的構(gòu)建及其