β-LG-CLA在胃腸道中穩(wěn)定性及其對LoVo細胞促凋亡分析.pdf

1、共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是一類具有特殊生理活性的多不飽和脂肪酸。近年來的研究已證實CLA對人體健康有多種益處，例如抗癌、抗粥樣動脈硬化和減肥等功效。體內(nèi)動物腫瘤實驗和體外細胞培養(yǎng)實驗表明，CLA能預(yù)防結(jié)腸腫瘤。CLA攝入后消化吸收過程中胃部低pH值環(huán)境會影響其活性，降低其抑制結(jié)腸癌LoVo細胞的活性。
　　 本課題選擇了β-乳球蛋白作為載體物質(zhì)來保護CLA的生理活性。β-乳球蛋白是牛

2、乳清蛋白的重要組成成分，是由乳腺上皮細胞合成的乳特有的蛋白質(zhì)。β-LG作為Lipocalin蛋白家族的成員，其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部有一個特殊的可以與小疏水分子結(jié)合calyx結(jié)構(gòu)，且β-乳球蛋白在體內(nèi)不易被胃消化，這種耐受低pH，不易降解的特性使其成為口服結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)中理想的抗腫瘤藥物緩釋靶向載體之一。
　　 本研究通過以下四個部分展開：
　　 (1)β-LG-CLA復(fù)合物的制備及穩(wěn)定性分析，綜合采用熱處理和滴定法制備β

3、-LG-CLA復(fù)合物，并通過Delsa Nano Czeta(ζ)電位和粒徑分析儀檢測模擬胃腸道pH環(huán)境作用下其粒徑大小和ζ電位的變化，通過SDS-PAGE電泳檢測模擬胃腸道酶環(huán)境作用下的穩(wěn)定性，以此來探討β-LG-CLA復(fù)合物靶向腸道過程中分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；
　　 (2)LoVo細胞的形態(tài)學(xué)觀察，倒置顯微鏡下觀察不同濃度的β-LG-CLA復(fù)合物處理LoVo細胞后的形態(tài)學(xué)變化，初步判斷復(fù)合物是否對LoVo細胞的增殖有影響；

4、>　　 (3)p-LG-CLA復(fù)合物對LoVo細胞的增殖抑制和促進凋亡作用的研究，用WST-1法檢測細胞增殖抑制率；倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化；Hoechst33258熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；
　　 (4)β-LG-CLA復(fù)合物促進LoVo細胞凋亡信號傳導(dǎo)機制的研究，JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位的改變；caspase活性檢測；western blot檢測CytC表達量變化

5、。
　　 通過以上研究我們得到了以下結(jié)果：
　　 (1)將c9，t11-CLA逐滴加入到預(yù)熱到50℃的β-LG溶液中，成功制備出β-LG-CLA復(fù)合物，使用Delsa Nano Czeta(ζ)電位和粒徑分析儀檢測到β-LG-CLA復(fù)合物在胃pH環(huán)境下(pH1-3)，β-LG-CLA復(fù)合物的ζ電位處于40 mV至16mV之間；在腸道pH環(huán)境(pH6.0-7.4)，β-LG-CLA復(fù)合物的ζ電位均低于-40 mV，粒徑大小

6、分布在170 nm左右。SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)在模擬胃腸道酶環(huán)境作用下β-LG-CLA復(fù)合物僅發(fā)生輕微的分解。
　　 (2)WST-1法檢測β-LG-CLA復(fù)合物對LoVo細胞增殖抑制的實驗結(jié)果表明：同一藥物濃度的處理組隨培養(yǎng)時間的延長對Lovo細胞增殖的抑制率增強，同一作用時間下隨著藥物濃度梯度增加對Lovo細胞增殖的抑制率顯著增強。
　　 (3)通過光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡鏡檢LoVo細胞形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)：β-LG

7、-CLA復(fù)合物不同濃度，不同作用時間下，LoVo細胞均出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率發(fā)現(xiàn)不同濃度的β-LG-CLA復(fù)合物處理組與對照組相比細胞凋亡率顯著增加。
　　 (4)JC-1試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)LoVo細胞在不同濃度的β-LG-CLA復(fù)合物作用下線粒體膜電位有不同程度的降低，同時檢測發(fā)現(xiàn)caspase的活性有不同程度的提高，線粒體中CytC的含量有不同程度的下降，相應(yīng)的，胞漿中Cyt C蛋白有所增加。
　　

8、 本課題利用β-LG分子結(jié)構(gòu)calyx具有結(jié)合小疏水分子的特性，創(chuàng)新性以β-LG作為載體與CLA結(jié)合，合成了微米級的靶向腸道治療腫瘤的物質(zhì)，β-LG-CLA復(fù)合物的載體β-LG本身不具有毒害作用，同時也證實了合成的β-LG-CLA復(fù)合物在胃腸道pH環(huán)境和胃腸道酶作用下都較穩(wěn)定，因而具有良好的靶向腸道治療腫瘤的應(yīng)用前景。
　　 本課題證實了不同濃度的β-LG-CLA復(fù)合物都具有抑制LoVo細胞增殖和促進其凋亡的作用，初步探討了其作