2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩80頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、肝活素( hepassocin, HPS),又名肝細胞衍生纖維蛋白原相關蛋白1(Hepatocyte-derived Fibrinogen-Related Protein1)或類纖維蛋白原1(Fibrinogen-Like1,FGL1),是一種肝臟特異性的促有絲分裂因子,并在肝部分切除、四氯化碳(CCl4)、D-氨基半乳糖(D-galN)等誘導的肝損傷修復中起重要作用。我們前期的研究表明HPS以表皮生長因子受體(EGFR)依賴方式激活M

2、APK信號通路并介導促進正常肝細胞增殖作用,但有關是否存在HPS特異受體及其受體分子還知之甚少。本研究在實驗室前期通過CHO細胞表達系統(tǒng)制備重組HPS的基礎上,建立了重組人HPS體外生物學活性測定方法,證實獲得高活性的重組HPS。進而采用免疫熒光實驗和受體結合實驗證實肝源細胞存在HPS特異受體。采用蛋白質(zhì)組學技術我們發(fā)現(xiàn)ANXA2分子是HPS受體候選分子,進一步我們通過多種方法證實ANXA2分子參與HPS膜信號的傳遞,表明ANXA2分子

3、至少是 HPS受體成分之一。這些研究結果為研究HPS介導的信號途徑及其在嚴重肝病治療中的應用提供了基礎。
  前期實驗室已成功構建了CHO-HPS表達細胞系,并獲得多批次HPS樣品,本研究驗證了重組HPS的理化性質(zhì)和純度,證實獲得高純度 HPS。進一步,我們通過優(yōu)化實驗條件,建立了基于EdU摻入的促肝細胞增殖及基于乳酸脫氫酶釋放的肝細胞保護兩種體外HPS生物活性檢測方法。實驗結果表明重組HPS以劑量依賴方式促進肝細胞增殖,抑制CC

4、l4誘導的乳酸脫氫酶釋放,表明我們獲得了高純度高活性的重組HPS,可用于HPS受體及其信號途徑和 HPS功能等研究。這兩種方法操作簡單、重復性好,較好地反映了HPS體內(nèi)通過促進肝細胞增殖、抑制肝細胞壞死救治急性肝損傷小鼠的活性,可用于重組HPS體外生物學活性的評價,為重組HPS質(zhì)量控制和研究HPS的功能奠定基礎。為證實細胞膜上是否存在HPS特異受體,我們首先采用FITC熒光標記HPS,并通過免疫熒光實驗觀察HPS是否能與肝細胞膜結合,結

5、果發(fā)現(xiàn)FITC標記的HPS可特異結合在L02肝細胞膜部位,提示L02細胞存在HPS特異結合受體。為驗證這一結果,我們采用經(jīng)典的碘標法標記HPS,體外生物活性檢測表明125I-標記的HPS保持了促進肝細胞增殖的活性,提示I-標記沒有破壞HPS的空間結構。受體結合實驗結果發(fā)現(xiàn)HPS與L02人肝細胞、HepG2人肝癌細胞及小鼠原代肝細胞的結合呈現(xiàn)典型的受體與配體的結合動力學方式,L02細胞的飽和濃度為1546.32ng/mL,HepG2細胞的

6、飽和濃度為2753.84ng/mL,小鼠肝實質(zhì)細胞的飽和濃度為2242.76ng/mL。L02細胞、HepG2細胞、小鼠原代肝細胞表面HPS受體數(shù)目分別為3.1×105sites/cell、1.8×105sites/cell和4.8×105sites/cell。小鼠原代肝實質(zhì)細胞受體數(shù)量較多,可能與該細胞體積比較大有關。Scatchard分析結果顯示,三種肝源細胞只存在一種HPS受體。HPS與L02細胞、HepG2細胞、小鼠原代肝細胞的

7、結合常數(shù)依次為6.71pmol/L、7.7nmol/L和2.17nmol/L。競爭實驗表明,高倍濃度非標的HPS能夠有效競爭125I-HPS與細胞的結合,符合受體配體間的競爭曲線。這些結果表明上述肝源細胞存在 HPS特異膜受體。檢測125I-HPS與非肝源細胞A549、Hela、EA926細胞的結合發(fā)現(xiàn),HPS與受體的結合具有肝特異性。用高濃度EGF、HGF不能競爭HPS與肝細胞的結合,說明HPS受體不同于EGF和HGF受體。進一步,我

8、們用配體與受體交聯(lián)實驗也證實HPS特異受體的存在。放射自顯影結果表明125I-HPS與受體形成的復合體大小約為110kD,已知HPS的單體去除 N端信號肽后分子量為34kD,二聚體是其發(fā)揮活性的構象,分子量大小為68kD,因此推測HPS受體的分子量約為42kD。
  為確認HPS的受體分子,我們采用蛋白質(zhì)組技術鑒定了HPS刺激后細胞膜蛋白質(zhì)磷酸化的變化,結果發(fā)現(xiàn)HPS刺激L02細胞顯著誘導40kD左右的酪氨酸磷酸化蛋白帶,對這一條

9、帶進行質(zhì)譜鑒定,得到4個候選蛋白,通過對候選蛋白質(zhì)組織分布、細胞定位、功能分析等綜合判斷,我們推測ANXA2分子可能為HPS的受體。進一步,我們驗證了HPS可誘導ANXA2發(fā)生酪氨酸磷酸化,HPS可與ANXA2在細胞膜共定位并發(fā)生相互作用;采用RNA干涉下調(diào)ANXA2表達,顯著降低125I-HPS與L02細胞的結合;下調(diào)ANXA2表達抑制了HPS誘導的EGFR磷酸化和MAPK通路的活化,并抑制了HPS促進L02細胞增殖和降低CCl4誘導

10、肝細胞損傷的活性。這些實驗結果表明ANXA2是HPS信號通路的關鍵分子,參與了HPS與肝源細胞的結合過程,是HPS受體或者至少是HPS受體的組成部分。
  我們還通過同源建模的方法建立了HPS的三維結構,通過對模型進行優(yōu)化,最終建立了一個高質(zhì)量的HPS三維結構模型。將此模型與ANXA2進行剛性對接,并結合構型進行多重優(yōu)化,獲得HPS與ANXA2最佳的結合構型。ANXA2與HPS相互作用的殘基為:PHE72、GLN69、MET11。

11、與之對應的HPS作用的殘基為:Glu59、Leu55、Lys65。
  HPS受體的確認對闡明HPS信號通路、功能及在嚴重肝病治療中的作用等多個方面具有重要意義,同時,HPS受體也可能成為肝臟疾病的靶點,用于新藥的研發(fā)。雖然本實驗初步確認ANXA2參與HPS與細胞結合的過程,但ANXA2缺乏嚴格的肝組織特異性,不能從組織分布的角度解釋 HPS特異促進肝細胞增殖的作用機制,此外,我們前期的研究表明HPS刺激肝細胞增殖依賴于EGFR的

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論