基于腸道菌群失調(diào)并過敏性哮喘大鼠TLRs-NF-κB信號轉導通路及腸道菌群16SrDNA的“肺與大腸相表里”免疫機制研究.pdf

1、目的：1.構建腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠模型；2.初步探索腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型中肺、腸免疫與腸道菌群的關系及作用機制；3.分別從肺腸合治、治肺法和治腸法三個方面治療腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘大鼠，以比較、驗證治肺法、治腸法與肺腸合治法對模型大鼠的有效性，進一步探索和驗證腸道微生態(tài)和肺、腸免疫調(diào)節(jié)的關系與機制，為中醫(yī)理論“肺與大腸相表里”的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.予SD大鼠飲用頭孢哌酮水溶液和

2、灌胃白色念珠菌造成大鼠腸道菌群紊亂，再利用皮下注射和霧化吸入卵清蛋白的方式構建腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型。分別從個體、組織細胞、分子水平評價模型的有效性；
　　2.通過分析腸道菌群16SrDNA以及TLRs/NF-κB信號轉導通路中TOLL樣受體2（TOLL-like receptors2，TLR2）、TLR4、MyD88、TARF6和β-arrestin mRNA在肺和腸組織的表達水平，并進行相關性分析，探索腸道菌群失調(diào)合并

3、過敏性哮喘肺部免疫與腸道免疫的關系及作用機制；
　　3.以“升降散”、“桂枝加厚樸杏子湯”和“增液承氣湯”灌胃模型大鼠，從個體、細胞和分子水平進行檢測分析，以比較、驗證治肺法、治腸法與肺腸合治法對模型大鼠的有效性，進一步探索和驗證腸道微生態(tài)和肺部免疫調(diào)節(jié)的關系與作用機制，為中醫(yī)理論“肺與大腸相表里”的臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　結果：
　　1.腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型的構建及有效性評價
　　模型組大鼠跟空白

4、組比較，呼吸頻率顯著上升，肺泡灌洗液（BALF）和
　　血液中嗜酸性粒細胞以及血液中淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞的數(shù)量均顯著升高，肺組織切片出現(xiàn)明顯的病理學改變，血液中IgE顯著升高，sIgA顯著降低，各種改變均具有統(tǒng)計學差異，說明模型組發(fā)生了典型的哮喘相關的病理學改變；模型組BALF中IL-4和IFN-γ的含量跟空白組比較均發(fā)生了顯著性改變，具體表現(xiàn)為IL-4升高，IFN-γ降低，肺組織中GATA-3 mRNA的表達水平顯著性

5、高于空白組，均具有統(tǒng)計學差異，說明模型組大鼠出現(xiàn)了以Th2增多為主的Th1/Th2失衡。
　　2.肺、腸道免疫與腸道菌群機制研究
　　模型組腸道菌群多樣性比空白組明顯降低，腸道正常菌群擬桿菌門和變形菌們減少，同時有害菌群梭狀芽孢桿菌和幽門螺旋桿菌增加，陽性組腸道菌群多樣性逐漸恢復。模型組的肺組織中TLR4與MyD88、TRAF6、β-arrestin mRNA表達量比空白組和陽性組均顯著性升高（P<0.05），除了TRAF6

6、 mRNA其余三個mRNA變化呈正相關性；模型組的腸組織中TLR4與MyD88、TRAF6、β-arrestin mRNA表達量均高于空白組和陽性組，但只有TLR4 mRNA表達量具有統(tǒng)計學意義，同時MyD88、TRAF6和β-arrestin的mRNA表達量呈正相關性。
　　3.三種治法對模型動物影響的比較
　　“加味升降散”對模型大鼠無論在呼吸頻率、氣道高反應性、肺組織病理切片分析、BALF中嗜酸性粒細胞數(shù)目以及IgE的

7、變化，以及T-bet/GATA-3和IFN-γ、IL-4含量變化均具有最佳的調(diào)節(jié)作用，且都與模型組差異顯著（P<0.05），對腸道菌群多樣性具有恢復作用但是不如治腸組；“增液承氣湯”對腸道菌群多樣性的恢復效果最佳，對氣道高反應性、BALF中白細胞總數(shù)和嗜酸性細胞數(shù)量以及血液中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數(shù)量均有很好的調(diào)節(jié)作用（P<0.05）；“桂枝加厚樸杏子湯”對腸道菌群多樣性的恢復不如治腸組，對模型動物呼吸頻率的改善和調(diào)節(jié)血液中嗜酸性粒細

8、胞都有明顯的優(yōu)勢，還能有效地升高Th1分化細胞特有的細轉錄因子T-bet mRNA的表達量（P<0.05）。各治療組肺組織中TLR2、MyD88和TRAF6 mRNA的表達水平均顯著性地低于模型組（P<0.05），只有治肺組和肺腸合治組肺組織的TLR4和β-arrestin mRNA的表達量均低于模型組且具有統(tǒng)計學意義；各治療組腸組織中TLR2、MyD88和TRAF6 mRNA的表達水平均高于模型組，但只有TLR2在肺腸合治組和治肺組以

9、及TRAF6在治肺組和治腸組差異具有統(tǒng)計學意義；只有治腸組的β-arrestin mRNA的表達量高于模型組且具有統(tǒng)計學意義。
　　結論：
　　1.通過灌胃大鼠頭孢哌酮和白色念珠菌，利用卵清蛋白進行致敏和霧化，成功構建了腸道菌群失調(diào)合并過敏性哮喘模型；
　　2．過敏性哮喘合并腸道菌群失調(diào)大鼠模型中，依賴于MyD88的TLRs/NF-κB信號轉導通路同時參與了肺部和腸道的免疫調(diào)節(jié)，β-arrestin作為上游調(diào)節(jié)因子對該

10、信號轉導通路具有正向調(diào)節(jié)作用，肺組織中TLRs/NF-κB信號轉導通路對Th1/Th2具有負向調(diào)節(jié)作用。
　　3.各治療組無論對腸道菌群的多樣性的恢復還是對過敏性哮喘相關病理指標的改善均具有促進作用，說明三種方法均能同時調(diào)節(jié)肺和腸的免疫狀態(tài)，只是各治療組對不同病理指標的作用程度有差異。綜合各項病理指標肺腸合治組效果最佳。各治療組均通過TLRs/NF-κB信號轉到通路參與腸和肺的免疫調(diào)節(jié)，但是在肺組織中通過下調(diào)依賴于MyD88的TL