利用羅非魚下腳料生產(chǎn)抗菌營養(yǎng)復(fù)合型活性肽的工藝研究.pdf

1、每年，我國水產(chǎn)加工行業(yè)產(chǎn)出的羅非魚下腳料數(shù)量巨大。羅非魚下腳料中營養(yǎng)物質(zhì)多樣，富含蛋白質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)高效的動物蛋白質(zhì)源。但是目前對羅非魚下腳料的利用還處在落后階段，只有少部分被加工咸魚粉等低值產(chǎn)品，大部分被丟棄，造成了資源浪費(fèi)的同時且加劇了對自然環(huán)境的污染。如何將這些寶貴的資源高值化利用起來，成為世界科學(xué)工作者們研究熱點(diǎn)。
　　近年來，隨著對飼用活性肽的深入研究，其越來越多的生理功能被發(fā)掘出來，顯示出巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景?？咕?/p>

2、肽和營養(yǎng)小肽作為飼用活性肽的重要成員，被認(rèn)為是目前最具潛力的飼用抗生素替代品。但由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜，產(chǎn)品成本高，污染排放大，產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展緩慢。若能將兩者生產(chǎn)工藝合二為一，可以簡化工藝，大幅度降低成本，且能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)零排放，從而突破高效產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)瓶頸。
　　針對以上存在的問題，本文擬利用羅非魚下腳料作為主要的營養(yǎng)基質(zhì)，加入一定量的麩皮和甘蔗渣作為通氣的物質(zhì)，接入納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）NT-6，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)同時

3、含脂肽和小肽的復(fù)合型活性肽飼料，優(yōu)化了發(fā)酵條件和發(fā)酵基質(zhì)，最大化抗菌脂肽的產(chǎn)量，探究了整個發(fā)酵過程中各參數(shù)指標(biāo)的動態(tài)變化并以此為依據(jù)建立發(fā)酵動力學(xué)模型，接著對基質(zhì)進(jìn)行二次酶解并對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化制得活性多肽，將酶解得到的多肽分離純化，找出其中的活性肽并對其進(jìn)行質(zhì)譜檢測，進(jìn)而確定活性小肽的分子量及氨基酸序列，最后檢測發(fā)酵終產(chǎn)物的各參數(shù)指標(biāo)，評估產(chǎn)品品質(zhì)。本研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.探究了羅非魚下腳料與麩皮的配比、甘蔗渣添加量、初

4、始基質(zhì)水分含量、初始pH、接種體積、發(fā)酵溫度及時間這七個因素對抗菌脂肽產(chǎn)量的影響，利用LC-MS法定量檢測抗菌脂肽的產(chǎn)量，在單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)，結(jié)果表明:羅非魚下腳料與麩皮配比3.48∶1，時間61.69h，初始基質(zhì)水分含量69.34％，溫度28.97℃時，抗菌脂肽產(chǎn)量最高，達(dá)7.32g/kg。通過此優(yōu)化，抗菌脂肽的產(chǎn)量得到了明顯提高。
　　2.監(jiān)測了整個發(fā)酵過程的各理化指標(biāo)(pH、

5、溫度、水分)、抗菌脂肽含量、蛋白水解度、蛋白含量、菌體生長及酶活力等的動態(tài)變化，通過Origin軟件對納豆菌生長、蛋白消耗及脂肽生成的實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并以此為依據(jù)建立相應(yīng)的發(fā)酵動力學(xué)模型，結(jié)果表明，得到的擬合方程R2均在0.98以上，擬合效果良好，此研究為我們將此工藝擴(kuò)大化應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。
　　3.對發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行二次酶解，以水解度為衡量指標(biāo)，探究溫度、時間、pH及水料比對內(nèi)源酶酶解蛋白程度的影響，單因素實(shí)驗表明以上

6、四種因素對水解度均有顯著的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到最佳的酶解工藝:溫度48.56℃，pH7.43，水料比1.07∶1，時間8.29h，水解度達(dá)最大為37.56％，從而實(shí)現(xiàn)活性小肽產(chǎn)率最大化。
　　4.本試驗對發(fā)酵酶解終產(chǎn)物中的有效成分進(jìn)行了全面分析，包括營養(yǎng)小肽、抗菌脂肽和其他技術(shù)指標(biāo)的測定。一方面利用超濾技術(shù)分離羅非魚下腳料蛋白酶解液得到產(chǎn)物多肽液，分別檢測各組分的自由基清除活性，其中以1000Da以下活性最高(5

7、6.85％)，再將這一組分通過SephadexG-25凝膠色譜技術(shù)進(jìn)一步分離純化，得到5個洗脫峰，分別為TPH-1、TPH-2、TPH-3、TPH-4和TPH-5，其中以TPH-4活性最強(qiáng)(70.58％)，后通過LC-MS/MS法測定TPH-4，最終確定TPH-4含有兩種小肽，分子量分別為566.47和679.52，經(jīng)分析其對應(yīng)的氨基酸序列分別為Leu-Asn-Asp和Leu-Met-Leu-Leu;另一方面利用LC-MS法檢測分析干燥

8、終產(chǎn)物中抗菌脂肽的組成成分及含量，結(jié)果表明終產(chǎn)物中的抗菌脂肽主要含Surfactin(995.20，1008.20，1058.20)和Iturin(1044.30，1071.20)兩類，另外還有很少量的Fengycin(1493.00)，含量達(dá)6.93g/kg;此外還測得終產(chǎn)物復(fù)合飼料中粗蛋白含量達(dá)32.13g/100g（干重），寡肽含量為12.09％，水解度達(dá)37.32％，益生菌納豆菌數(shù)量為9.0×108cfu/g（干重），發(fā)酵前后蛋