MAPK家族成員在燒傷引起的內皮細胞激活過程中不同作用.pdf

1、研究目的：血管通透性增高和白細胞黏附是創(chuàng)傷、燒傷、休克和炎癥等許多病理過程中的重要變化，特別在燒傷性休克中對病情的發(fā)展和轉歸具有重要的影響。由于其發(fā)生機制一直沒有充分闡明，目前尚未找到防治燒傷血管通透性紊亂的有效措施，因此探索血管通透性增高的信號轉導機制極為重要。本實驗室過去的工作證明，阻斷G蛋白受體的激酶，Rho激酶，可以阻斷燒傷血清引起的血管內皮細胞應力纖維的形成，并改善燒傷引起的血管通透性增高。我們還發(fā)現PKC、ERK和p38都參

2、與了燒傷引起的內皮細胞肌動蛋白重組，尤其是p38α、p38δ發(fā)揮了相對更重要的作用。為了進一步研究p38上游及其下游信號通路在燒傷引起的內皮細胞功能改變、血管通透性增高以及白細胞黏附中發(fā)揮的作用，本研究采用分子生物學和組織學等手段，在分子水平、細胞水平觀察正常及燒傷血漿刺激所致的內皮細胞骨架蛋白緊密連接蛋白的變化同血管通透性的關系；觀察p38信號通路對內皮細胞黏附分子、內皮細胞骨架蛋白的調節(jié)作用：探討ICAM-1表達調控的機制，期待為闡

3、明燒傷內皮細胞功能紊亂的機制提供一定的依據，為血管通透性紊亂的防治提供新的治療靶點。
　　 研究方法：
　　 1、制備燒傷血漿：用我室方法，將200g-250gSD大鼠給予大于體表1/3面積的燙傷，隨后經頸動脈取血，離心，保留上清備用；正常大鼠血漿制備采用37℃溫水浸浴30s，余同燒傷大鼠。
　　 2、按照實驗分組，分別用MAPKs的特異性抑制劑和腺病毒載體預處理內皮細胞，然后給予燒傷血漿刺激，觀察抑制MAPKs

4、及其下游通路活化后對燒傷血漿引起的內皮細胞反應的影響；
　　 3、用熒光探針標記燒傷內皮細胞F-actin、ICAM-1和ZO-1，然后采用激光共聚焦顯微鏡觀察它們的改變和重構；
　　 4、用Western blot觀察MAPKs相關蛋白的活化水平與燒傷引起的內皮細胞功能紊亂的關系。
　　 研究結果：
　　 1、燒傷血清可以有效激活內皮細胞的MAPKs通路。燒傷血清刺激5min后，JNK、p38、ERK的

5、磷酸化水平開始增高。p38的磷酸化水平在10 min時達到高峰，ERK的磷酸化水平在15min達到最高，而JNK的磷酸化水平20min時達到峰值。
　　 2、正常內皮細胞內的F-actin主要環(huán)繞在細胞周邊，排列緊密圓滑。燒傷血漿刺激1h后的內皮細胞，細胞骨架F-actin外周致密帶邊緣變得毛糙不規(guī)整，細胞中央有散在應力纖維形成。而給予p38的抑制劑SB203580或ERK的抑制劑PD98059預處理30 min，可明顯減少內皮

6、細胞應力纖維的形成；但阻斷JNK通路，未見明顯改變。
　　 3、p38的下游激酶MAPKAPK2(MK2)和PRAK都參與了燒傷血漿引起的內皮細胞骨架蛋白重組。用腺病毒載體使MK2持續(xù)活化時，可明顯使肌動蛋白重構，形成大量的應力纖維；持續(xù)活化PRAK也可起到類似作用，但并不明顯。同樣，使用病毒載體抑制MK2的活化時，可明顯減少燒傷血漿引起的應力纖維；阻斷PRAK作用不如阻斷MK2明顯。由此推斷，燒傷時，MK2與PRAK都參與了p

7、38介導的內皮細胞肌動蛋白的重構，但MK2的作用可能更加重要。
　　 4、p38介導的內皮細胞肌動蛋白細胞骨架的重構，可能是通過MK2和PRAK對HSP27的磷酸化實現的。燒傷血清刺激內皮細胞，可明顯增加HSP27的磷酸化水平：用腺病毒載體持續(xù)活化MK2可明顯增加HSP27的磷酸化水平，持續(xù)活化PRAK對HSP27磷酸化水平的作用不十分明顯；阻斷MK2可明顯抑制燒傷血漿引起的HSP27磷酸化水平的升高，阻斷PRAK也有部分類似作

8、用。而且上述結果與內皮細胞肌動蛋白骨架的形態(tài)相對應。
　　 5、阻斷PKC和Rho激酶都可以不同程度的緩解燒傷引起的內皮骨架蛋白排列紊亂。使用PKC和Rho的特異性抑制劑，都可以減少燒傷內皮細胞應力纖維的形成，抑制Rho激酶的活性還可以降低燒傷血漿引起的p38磷酸化水平。推斷PKC和Rho激酶參與燒傷血漿引起的內皮細胞活化。
　　 6、p38參與燒傷引起的內皮細胞緊密連接破壞。正常內皮細胞的ZO-1分布在細胞近內膜處，排

9、列緊密，邊緣光滑。燒傷刺激1h后，ZO-1分布呈環(huán)點狀，細胞輪廓模糊，胞漿內彌散有ZO-1蛋白。用SB203580處理30 min后，可以抑制燒傷血漿引起的內皮細胞緊密連接Z0-1分布的改變，細胞輪廓清晰，ZO-1仍均勻分布在細胞周邊；抑制ERK通路沒有保護作用。
　　 7、正常內皮細胞ICAM-1表達很少：而在燒傷血漿刺激24h后，ICAM-1表達明顯增多，而給予JNK的特異性抑制劑預處理后，明顯抑制了燒傷血漿引起的ICAM-

10、1表達。提示JNK參與調控了燒傷引起的內皮細胞ICAM-1的表達，可能在白細胞黏附以及遷移中發(fā)揮了一定的作用。
　　 結論：
　　 1、我們發(fā)現在燒傷血漿刺激的內皮細胞，MAPKs被激活；
　　 2、PKC和Rho激酶參與調節(jié)了燒傷時人皮膚微靜脈內皮細胞應力纖維的形成；
　　 3、p38和ERK參與調節(jié)了燒傷內皮細胞骨架肌動蛋白的重構和應力纖維的形成，p38還參與了燒傷內皮細胞緊密連接的破壞過程；