miR-103a-1對hERG編碼的Ikr特性的作用研究.pdf

1、目的：心源性猝死（Sudden Cardiac Death，SCD）絕大部分是由惡性心律失常所誘發(fā)的，但由于其惡性心律失常發(fā)病的機(jī)制仍不是非常清楚，臨床上暫時(shí)無有效的預(yù)防和治療SCD的方法。大量研究證實(shí)，hERG鉀通道離子電流在動(dòng)作電位的3期復(fù)極化中起著重要的作用，且已證實(shí)LQT2的發(fā)生是由hERG基因通道功能的改變引起的。在我國，以II型LQT2致命性心律失常多見。已有研究證實(shí)，microRNAs（miRNAs）參與了hERG途徑的功

2、能調(diào)節(jié)。本研究組前期已通過雙熒光素酶報(bào)告基因法、實(shí)時(shí)定量 PCR、Western Blotting、激光共聚焦篩選出 miR-103a-1與 hERG基因具有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)旨在在電生理水平進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-103a-1與 hERG的相關(guān)性，探討 miR-103a-1作為新的工具來評估LQTS發(fā)生機(jī)制的可行性，并為研發(fā)新的高特異性抗心律失常藥提供新思路。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)的人胚腎細(xì)胞（HEK293T）是進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)理想的細(xì)胞系

3、。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hERG后進(jìn)再一步轉(zhuǎn)染cel-miR-67、miR-103a-1或miR-103a-1加AMO-103a-1。pRK5-GFP用于監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率。cel-miR-67作為隨機(jī)陰性對照。應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測miR-103a-1對hERG蛋白通道的Ikr電生理特性的影響，HEK293T細(xì)胞收獲在24小時(shí)（僅hERG質(zhì)粒），48小時(shí)（hERG后再轉(zhuǎn)染miR-103a-1或cel-miR-67）或72小時(shí)（hERG的質(zhì)粒隨后的miR

4、-103a-1和AMO-103a-1）轉(zhuǎn)染后相對應(yīng)。
　　結(jié)果：1. miR-103a-1對hERG通道Ikr電流幅度的影響：
　　miR-103a-1干擾 hERG前后Ikr激活電流幅度分別為660.67±159.55 pA和253.72±47.35 pA，干擾后比干擾前顯著降低了61.60％（n=6，p<0.05）；尾電流的電流幅度分別為981.28±5.94 pA和376.23±2.84 pA，干擾后比干擾前降低了61

5、.66%（n=6，p<0.05）。而陰性對照cel-miR-67未能影響Ikr激活電流（干擾前：660.67±159.55pA，干擾后：691.30±143.57 pA，4.6%，n=6，P>0.05）和尾電流（cel-miR-67干擾前：981.28±5.94pA，干擾后：985.79±3.96 pA，0.45%，n=6，P>0.05）的幅度。正如預(yù)期的，AMO-103a-1可以沉默 miR-103a-1的影響。共轉(zhuǎn)染 miR-103

6、a-1和AMO-103a-1的細(xì)胞激活電流幅度從253.72±47.35 pA(n=6)（僅轉(zhuǎn)染hERG和miR-103a-1）恢復(fù)到595.75±99.08 pA(n=6)(p<0.05),同樣尾電流的幅度也從376.23±2.84 pA恢復(fù)到984.58±6.49 pA(n=6)(p<0.05)。與僅轉(zhuǎn)染 hERG的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染 miR-103a-1和AMO-103a-1顯示出在激活電流（595.75±99.08 pA vs66

7、0.67±159.55 pA，p>0.05）和尾電流（984.58±6.49 pA vs981.28±5.94 pA，p>0.05)方面僅有微小的差異。
　　2.miR-103a-1對hERG通道Ikr電流的特性的影響。
　　（1）miR-103a-1干擾hERG鉀通道前后Ikr電流的斜率因子從9.99±0.34 mV減少為6.88±0.44 mV（n=6，P<0.05），而半激活最大電壓分別為-8.66±0.38 mV和-

8、25.31±0.52 mV（n=6，p<0.05）。與野生型hERG通道相比，miR-103a-1干擾hERG后使得通道明顯向復(fù)極化方向偏移，斜率變小。有趣的是，cel-miR-67干擾 hERG前后V1/2分別為-8.66±0.38 mV和-20.07±3.30 mV（n=6，p<0.05），而斜率因子K沒有變化（9.99±0.34 mV VS9.49±0.27mV，n=6，p>0.05）。轉(zhuǎn)染miR-103a-1加AMO-103a-

9、1干擾hERG前后V1/2分別為-8.66±0.38 mV和-18.64±0.45 mV(n=6，p<0.05)，K分別為9.99±0.34 mV和8.29±0.39 mV（n=6，p>0.05）。轉(zhuǎn)染 miR-103a-1加 AMO-103a-1與只轉(zhuǎn)染 miR-103a-1干擾hERG前后V1/2和K沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。
　?。?）穩(wěn)態(tài)失活電流中，miR-103a-1干擾hERG前后V1/2和K沒有明顯變化（干擾前

10、V1/2=-39.07±3.13 mV，K=14.96±2.88 mV；干擾后V1/2=-46.88±4.35mV，K=11.30±3.90 mV；n=6，p>0.05）。同樣cel-miR-67干擾hERG前后V1/2和K也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。轉(zhuǎn)染miR-103a-1加上AMO-103a-1干擾hERG前后V1/2和K同樣也沒有明顯變化。轉(zhuǎn)染miR-103a-1加AMO-103a-1與只轉(zhuǎn)染miR-103a-1干擾hERG前后V1/2和K

11、沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）miR-103a-1干擾 hERG后Ikr電流的失活速度更快（n=6，P>0.05），另外，AMO-103a-1幾乎消除了miR-103a-1的影響，而陰性對照cel-miR-67沒有影響hERG通道蛋白的失活時(shí)間常數(shù)。
　　（4）miR-103a-1或cel-miR-67干擾hERG前后Ikr電流失活后恢復(fù)時(shí)間常數(shù)沒有差異（n=6，P>0.05），并且對 IKr去失活恢復(fù)時(shí)間常數(shù)的快、慢成分也無