Curli細(xì)胞分泌途徑中重要蛋白的表達(dá)純化及結(jié)構(gòu)功能分析.pdf

1、淀粉樣蛋白纖維(Amyloids)是一類錯誤折疊引發(fā)疾病的蛋白聚集體。近年來人們在細(xì)菌、真菌、蛛形鋼動物、魚和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了功能淀粉樣蛋白纖維。Curli是一種典型的功能淀粉樣纖維;在生物膜形成過程中，Curli是細(xì)胞外基質(zhì)重要的組成部分，且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的吸附能力、細(xì)胞間相互作用和穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)、促使成熟的生物膜形成等重要功能。此外，Curli與一系列淀粉樣疾病相關(guān)，如阿爾茲海默病(Alzheimer disease，AD)，帕金森

2、病(Parkinson's disease，PD)，2型糖尿病(Type-2 diabetes)和腎功能衰竭等。
　　Curli是由富含β-折疊的高度有序蛋白亞基胞外聚集，形成4-7 nm寬無分支細(xì)長的一類具有功能的淀粉樣蛋白。Curli是由CsgA和CsgB兩種亞基組成，且每種亞基都含有5個重復(fù)的谷氨酸和天冬氨模體，均表現(xiàn)出淀粉樣蛋白的生化特征。CsgE和CsgF是Curli分泌途徑中兩個重要的分子伴侶，周質(zhì)空間的CsgE直接與

3、CsgA相互作用防止其在周質(zhì)空間過早聚集，在細(xì)胞外膜上的CsgF參與CsgB調(diào)控CsgA的聚合。CsgG蛋白是Curli分泌途徑中鑲嵌在外膜上的膜蛋白，與Curli亞基CsgA等轉(zhuǎn)運至胞外密切相關(guān)。本研究以革蘭氏陰性菌大腸桿菌CFT073為材料，以其基因組DNA為模板，通過分子克隆手段，克隆出Curli分泌途徑中重要的三個基因:csgF、csgE、csgG;通過生物信息學(xué)分析三個基因，構(gòu)建不同的重組質(zhì)粒，研究其表達(dá)水平;通過研究CsgF

4、、CsgE、CsgG三種蛋白的純化條件，獲取高純化和穩(wěn)定的蛋白表達(dá)純化條件;通過蛋白結(jié)晶條件的研究，獲得蛋白晶體并進行數(shù)據(jù)分析;通過蛋白的互作功能研究，獲得蛋白之間功能關(guān)系。主要的研究結(jié)果如下:
　　1、Curli分泌系統(tǒng)中關(guān)鍵基因csgF的克隆、表達(dá)和純化。以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了csgF重組表達(dá)質(zhì)粒:pET-28a-CsgF-Full-C-6His、pET-28a-CsgF-nsp-N-6His、pET-28a-CsgF

5、-nsp-C-6His、pET-28a-CsgF-(20-129)-C-6His;通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，CsgF蛋白表達(dá)條件為:18℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)16-20 h;通過構(gòu)建CsgF(20-129)截短體和純化條件優(yōu)化，CsgF(20-129)截短體穩(wěn)定存在條件為:50 mmol/L醋酸鈉、150 mmol/L NaCl、5％ Glycerol。
　　2、Curli分泌系統(tǒng)中關(guān)鍵基因csgE的克隆、表達(dá)和純化。以生

6、物信息學(xué)為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建了CsgE重組表達(dá)質(zhì)粒成功的構(gòu)建了pET-22b-CsgE-C-6His;通過誘導(dǎo)條件優(yōu)化，CsgE蛋白表達(dá)在18℃、0.1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)16-20 h條件下，成功使csgE基因在周質(zhì)空間獲得表達(dá);通過對CsgE重組蛋白的純化及條件優(yōu)化，最后在25mmol/L Tris-HCl、pH7.0、150 mmol/L NaCl、5％glyercol中獲得了穩(wěn)定的高純化的CsgE蛋白。
　　3、Cu

7、rli分泌系統(tǒng)中關(guān)鍵基因csgG的克隆、表達(dá)和純化。以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，成功的將csgG基因克隆在pQLink-N表達(dá)載體上，獲得了pQLink-N-CsgG-6His重組質(zhì)粒;CsgG蛋白表達(dá)在18℃、0.1mmol/L IPTG、誘導(dǎo)16-20 h條件下獲得表達(dá);通過對CsgE重組蛋白的純化及條件優(yōu)化，最后在Buffer:25mmol/L Tris-HCl，pH7.0、150 mmol/L NaCl、5％glyercol、0.06％

8、 LDAO獲得了穩(wěn)定高純化的CsgG蛋白。
　　4、CsgF、CsgE蛋白結(jié)晶分析及數(shù)據(jù)處理。開展了CsgF、CsgE蛋白晶體生長條件的篩選，成功的到了CsgE蛋白的晶體，CsgF未能獲得晶體;通過對CsgE蛋白晶體的優(yōu)化，最后在0.1 mol/L Imidazole、pH6.7、19.5％ PEG6000條件下獲得了大的菱形晶體;在上海同步輻射中心(SSFR)對CsgE蛋白晶體進行X-Ray衍射，獲得了1套分辨率為2.3(A)的

9、X-Ray數(shù)據(jù);通過在線數(shù)據(jù)處理軟件分析，確定CsgE蛋白晶體的空間群為:P42212，晶胞參數(shù):a=72.992; b=72.992;c=81.279。
　　5、CsgF、CsgE和CsgG蛋白之間互作功能分析。體內(nèi)融合表達(dá)csgE-csgG復(fù)合物，成功構(gòu)建了pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-6His、pQLink-N-csgG-12GS-csgE-C-6His和pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-

10、6His;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌中進行表達(dá)，通過Western blotting assay分析鑒定，并用鎳柱親和層析進行純化，純化后的融合蛋白CsgG-6GS-CsgE-C-6His進行聚集狀態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以高聚的形式存在;進一步純化CsgG-12GS-CsgE-C-6His、CsgG-14GS-CsgE-C-6His蛋白以及純化條件的優(yōu)化，均未能獲得穩(wěn)定的低聚融合蛋白;此外，開展體外重組的方式，分別將表達(dá)純化好的Csg