聚乙二醇化多西他賽白蛋白納米粒的制備及其抗人非小細(xì)胞肺癌的研究.pdf

1、在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇乳化揮發(fā)交聯(lián)法制備了多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel albumin nanoparticles，DANPs)和PEG化多西他賽白蛋白納米粒(docetaxel loadedPEG-albumin nanoparticles，PEG-DANPs)。然后我們研究了DANPs和PEG-DANPs的表征，并進(jìn)行了體外方面的一系列研究，包括:體外溶血反應(yīng)、體外釋放及其對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡和

2、攝取的情況;在體內(nèi)方面，我們分別建立了人非小細(xì)胞肺癌移植瘤及原位癌模型，分別研究了Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs三種藥物對(duì)移植瘤模型瘤塊抑制及體重減輕情況及藥物對(duì)原位癌裸鼠的抗瘤及抗轉(zhuǎn)移等情況，結(jié)果證明，PEG-DANPs對(duì)于NSCLC是一種十分安全、有效的治療藥物制劑。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:
　　1.乳化揮發(fā)交聯(lián)法制備PEG化多西他賽白蛋白納米粒(PEG-DANPs)
　　DTX原料藥溶于氯仿和乙醇中

3、，白蛋白溶于無(wú)菌水中，將兩者混合后移至高壓乳均機(jī)內(nèi)，20000 psi下進(jìn)行乳化12個(gè)循環(huán)，將所得的溶液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)使氯仿迅速除去，最終得到具有藍(lán)色乳光的半透明狀分散液，經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干，復(fù)溶后過(guò)0.22μm膜，制成DANPs。
　　DANPs溶于硼酸緩沖液，再加入mPEG(20000 kDa)，在室溫下于攪拌儀中反應(yīng)3h，最后加入甘氨酸(11mg/mL)終止反應(yīng)。將反應(yīng)物移至70 kDa透析膜中旋轉(zhuǎn)過(guò)濾半小時(shí)后冷凍，合成物干

4、燥備用。復(fù)溶后DANPs和PEG-DANPs用碘染色及考馬斯藍(lán)染色，進(jìn)行PAGE膠電泳，結(jié)果顯示PEG-DANPs合成成功。
　　2.動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定DANPs和PEG-DANPs的粒徑和電位
　　DANPs及PEG-DANPs凍干劑復(fù)溶，利用Malvern Nano ZS激光粒度分析儀測(cè)定其粒徑及電位。DANPs粒徑為163.4±3.76 nm，zeta電位平均為-19.4±0.18 mV;PEG-DANPs粒徑為169.

5、19±2.36 nm，zeta電位平均為-18.2±0.21 mV，說(shuō)明兩種納米顆粒大小合適，電位合理。
　　3.Hitachi H-7650電子顯微觀察DANPs和PEG-DANPs的形態(tài)
　　DANPs及PEG-DANPs凍干劑復(fù)溶，取10μL滴在蠟塊表面，另取表面膜化處理的銅網(wǎng)正面朝下覆于液滴上，放置10 min后取下銅網(wǎng)，用濾紙吸干銅網(wǎng)表面液體，取1％磷鎢酸溶液負(fù)染色10 min，取下銅網(wǎng)置于燈下烤干，透射電鏡下觀察

6、載藥納米粒的顯微形態(tài)。在透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DANPs及PEG-DANPs顆粒大小均勻，形狀接近規(guī)則的圓球形。
　　4.高效液相色譜法和(HPLC)和高速離心法測(cè)定DANPs和PEG-DANPs的載藥量和包封率
　　DANPs及PEG-DANPs凍干劑加入適量的乙腈復(fù)溶，采用HPLC法測(cè)定DANPs及PEG-DANPs中的藥物含量。DANPs的包封率為93.58±0.86％，載藥量為8.71±0.98％;PEG-DANPs的包

7、封率為95.4±5.5％，載藥量為8.72±1.05％。
　　5.藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種藥物及制劑的釋放特點(diǎn)
　　Aisu(@)、DANPs及PEG-DANPs分別配置成5 mg/mL的溶液，加入孔徑為10kD的透析袋中，兩端扎緊后將透析袋置于40 mLPBS緩沖液中恒溫振蕩。在一系列時(shí)間點(diǎn)取出樣品0.2 mL透析液，同時(shí)補(bǔ)充0.2 mL透析液，在透析完成后將透析袋剪破，攪拌均勻，作為時(shí)間無(wú)窮大時(shí)的藥物釋放量。使用HPLC

8、法測(cè)定濃度，分別繪制出三種體外藥物釋放曲線。根據(jù)所繪體外釋放曲線所示，Aisu(@)在2小時(shí)時(shí)已經(jīng)基本完全釋放，而DANPs和PEG-DANPs兩種制劑釋放均比較平緩，無(wú)突釋現(xiàn)象，反映出藥物白蛋白納米粒的穩(wěn)定性以及釋放的緩釋性。另外，PEG-DANPs較DANPs的釋放更加平緩，在血漿中的滯留時(shí)間更長(zhǎng)，緩釋效應(yīng)更加突出。
　　6.藥物體外溶血實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)三種藥物及制劑對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞的破壞情況
　　取新鮮豚鼠血除去纖維蛋白后，加0.

9、9％生理鹽水離心洗滌直至上清液不再顯示紅色為止，加入5％葡萄糖注射液配制成2％(v/v)的紅細(xì)胞混懸液。取Aisu(@)，DANPs以及PEG-DANPs制劑;另取同體積新鮮蒸餾水作為陽(yáng)性對(duì)照組;取同體積5％葡萄糖注射液作為陰性對(duì)照組，向上述各管中分別加入同體積的2％紅細(xì)胞混懸液，置37℃的水浴1h后取出試管以2000 rpm離心5 min，吸取上清液在576 nm處測(cè)定各管溶液的吸收度計(jì)算各試驗(yàn)管樣品的溶血度值。結(jié)果顯示，與Aisu(

10、@)和DANPs進(jìn)行比較，在不同濃度下，PEG-DANPs的溶血程度均有所下降，提示其對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞的破壞作用最小。
　　7.三種藥物及制劑體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的研究
　　12只健康雄性豚鼠隨機(jī)分為3組，每組4只，分別尾靜脈注射Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs(20mg/kg)。于特定時(shí)間點(diǎn)各取血0.5 mL，置于肝素化的離心管中，離心(4000 rpm，10 min)，分離血漿，放入-20℃冰箱避光保存，利用HPLC

11、測(cè)定并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，PEG-DANPs與Aisu(@)及DANPs組比較，在t1/2、AUC、 Cl均有顯著性差異，說(shuō)明PEG-DANPs較Aisu(@)及DANPs在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)，具有更長(zhǎng)的生物半衰期和體內(nèi)滯留時(shí)間。
　　8.MTT法測(cè)定三種藥物及制劑對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制情況
　　A549細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以8×103個(gè)/孔加入96孔板，培育24h后，分別加入PBS液（陰性對(duì)照組）、Aisu(@)

12、、DANPs、PEG-DANPs，藥物濃度依次為0μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h及72h。吸棄舊培養(yǎng)基后加入20μL MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速振蕩10 min，測(cè)定在490 nm處的吸光度值，記錄結(jié)果，計(jì)算不同藥物濃度下細(xì)胞增殖抑制率并軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示，三種藥物都對(duì)A549細(xì)胞

13、表現(xiàn)出相同的濃度-時(shí)間依賴型細(xì)胞毒性。在高濃度(1-100μg/mL)時(shí)，Aisu(@)制劑比DANPs和PEG-DANP納米粒制劑抑制癌細(xì)胞增殖的能力更強(qiáng);而在正常和低濃度區(qū)間(0.001-0.1μg/mL)時(shí)，納米粒制劑對(duì)于對(duì)于癌細(xì)胞增殖的抑制要高于Aisu(@)。存72小時(shí)，Aisu(@)制劑由于在血液中已經(jīng)幾乎檢查不到血藥濃度，因此，對(duì)細(xì)胞的抑制率也幾乎難以測(cè)出。
　　9.流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定三種藥物及制劑對(duì)A549細(xì)胞誘導(dǎo)凋

14、亡的情況
　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549腫瘤細(xì)胞，以1×105個(gè)/瓶傳代培養(yǎng)至4個(gè)25cm3培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)生長(zhǎng)至密度60％時(shí)加入對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs進(jìn)行干預(yù)，收集各組細(xì)胞，加Buffer結(jié)合液混勻，吹打均勻。室溫避光操作，加FITC混勻后，再加PI，室溫避光反應(yīng)30min。立即上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)結(jié)果可知，隨著對(duì)照組、Aisu(@)、DANPs和PEG-DANPs藥物的不同，在48小時(shí)這個(gè)特定時(shí)間

15、點(diǎn)上，右上象限(An+PI+)及右下象限(An+PI-)之和，即早凋、晚凋細(xì)胞和壞死細(xì)胞所占比例逐漸增多，分別為2.86％、25.85％、45.00％及50.65％，提示用藥組比對(duì)照組均能更顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在三者之間，PEG-DANPs較DANPs及Aisu(@)更能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡，即PEG-DANPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力是最強(qiáng)的。
　　10.激光共聚焦顯微鏡觀察DANPs和PEG-DANPs入胞情況
　　

16、收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于鋪有細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入已制備好的DANPs和PEG-DANPs，將6孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在達(dá)到特定時(shí)間點(diǎn)時(shí)，用鑷子將細(xì)胞爬片取出，用冷PBS緩沖溶液清洗3次后放在4％的多聚甲醛中固定。然后取出爬片倒置在載玻片上，用50％的甘油封片。在488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光條件下，用共聚焦顯微鏡觀察。香豆素6在488nm激光激發(fā)下顯綠色熒光，比較它們之間的鏡下情況，隨著制劑的不同，熒

17、光攝取強(qiáng)度也逐漸增大，結(jié)果顯示PEG-DANPs比DANPs更容易進(jìn)入A549細(xì)胞內(nèi)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　1.成功地構(gòu)建了PEG化多西他賽白蛋白納米粒;
　　2.PEG-DANPs粒徑合適，分布均勻穩(wěn)定，載藥量及包封率良好，具有明顯的緩釋效應(yīng)，對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞有較低的破壞作用;
　　3.PEG-DANPs能夠更好地進(jìn)入A549細(xì)胞，能夠有效地抑制A549細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡;
　　4.PEG-DANPs能夠有