基于輔基法的多酶體系定向共固定化研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、隨著多酶級聯(lián)催化的廣泛應用,多酶體系的共固定化也越來越受到關注。將多種酶在載體表面進行級聯(lián)結合,充分地利用不同酶種的催化特性,提高中間產(chǎn)物的運轉濃度,既能擴展酶催化的應用范圍,又可以提升多酶體系的整體反應效率,在很大程度上克服了單酶反應體系單一催化的局限性。而酶定向固定化是將酶蛋白有序地結合到載體的特定位點,能最大限度地保持酶的天然構象,有助于保護酶催化的功能,具有非常重要的研究應用價值。
  葡萄糖氧化酶(Glucose oxi

2、dase,GOD)和膽固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,ChOx),均以黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavine adenine dinucleotide,F(xiàn)AD)為催化反應活性中心。GOD和ChOx分別可以催化葡萄糖(Glucose)和膽固醇(Cholesterol)生成對應產(chǎn)物和過氧化氫(H2O2)。H2O2不僅會對酶造成損傷,還作為中間產(chǎn)物發(fā)生累積從而抑制反應的持續(xù)進行。辣根過氧化物酶(Horseradish pero

3、xidase,HRP),以血紅素(Hemin)為活性中心,可消耗H2O2,促進反應正向進行。因此GOD和ChOx可以與HRP分別構建GOD-HRP以及ChOx-HRP多酶級聯(lián)催化體系。這三種氧化還原酶,均存在輔基—即活性中心,因此可借助輔基-脫輔酶親和作用構建定向共固定化多酶體系。該方法能實現(xiàn)高度的定向化,且不涉及對酶分子的修飾改性,對酶損傷較小,具有廣泛的應用前景。
  本文采用輔基定向固定化的方法制備多酶級聯(lián)催化體系:首先借助

4、導電聚合物—聚苯胺(Polyaniline,PANI)在氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)表面構建了兩臂不對稱的“Y”型支架,分別將葡萄糖氧化酶(GOD)的輔基(黃素腺嘌呤二核苷酸,F(xiàn)AD)和辣根過氧化物酶(HRP)的輔基(血紅素,Hemin)固定在功能化的載體上,然后將脫輔基的酶與之重組,完成定向共固定化的GOD-HRP和ChOx-HRP多酶催化體系的構建。
  研究發(fā)現(xiàn),GOD-HRP多酶催化體系電化學活性比GO

5、D單酶體系提高約3.6倍,底物反應的線性范圍可達3~50mM;ChOx-HRP多酶催化體系電化學活性則比ChOx單酶體系提高約2.1倍,底物反應的線性范圍可達3~80mM。定向共固定后的多酶體系熱穩(wěn)定性和耐酸堿性也有所增強。其中,GOD-HRP體系可在pH6.5~7.0保有較高的催化活力,最佳反應溫度為35℃;ChOx-HRP體系適用于pH6.0~7.5環(huán)境,在35~45℃條件適用。
  通過改變導電高分子的長度,即調控多酶級聯(lián)催

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