TCF7L2基因多態(tài)性及RNA干擾對(duì)胰島素原水平的影響及機(jī)制.pdf

1、第一部分 TCF7L2、PCSK1和PCSK2基因多態(tài)性與2型糖尿病及胰島素原水平的相關(guān)性研究
　　目的：探討重慶地區(qū)漢族人群中TCF7L2(Transcription factor7-like2)、PCSK1(Proprotein convertase subtilisin/kexin type1)和PCSK2(Proprotein convertase subtilisin/kexin type2)的單核苷酸多態(tài)性(Singl

2、enucleotide polymorphisms，SNPs)和新診2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus，T2DM)及血清胰島素原水平的相關(guān)性。
　　方法：采用病例-對(duì)照研究方法，研究對(duì)象包括對(duì)照組(n=152例)，新診T2DM組(n=227例)。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)對(duì)TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951和PCSK

3、2的rs2021785位點(diǎn)進(jìn)行SNPs分型。采用酶聯(lián)免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)測(cè)定空腹血清胰島素原水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SAS8.1軟件，遺傳學(xué)分析采用在線軟件完成。
　　結(jié)果：Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)P>0.05，擬合度優(yōu)良。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)TCF7L2的rs7903146和rs11196218位點(diǎn)不存在連鎖不平衡現(xiàn)象，不能構(gòu)建單倍型(D'=0.348，r

4、2=0.018)。T2DM組PCSK2的rs2021785位點(diǎn)次要等位基因頻率(Minor allele frequency，MAF)顯著低于對(duì)照組(20.04％vs26.64％，p=0.0335)，在共顯性模型中，該位點(diǎn)的基因型分布與T2DM顯著相關(guān)[Odds ratio(OR)=0.627，95％CI(0.409，0.962)，p=0.0308]。TCF7L2的rs7903146位點(diǎn)的基因型分布和△I30/△G30顯著相關(guān)(OR=1

5、.012，95％CI1.000～1.025，P<0.05)，在校正了性別、年齡和BMI后，TT和CT基因型攜帶者的△I30/△G30顯著高于CC基因型攜帶者(P=0.0385)。T2DM組和對(duì)照組比較，TCF7L2的rs7903146和rs11196218和PCSK1的rs3811951位點(diǎn)的MAF和基因型分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上SNPs位點(diǎn)不同基因型攜帶者空腹血清胰島素原的水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，不同基

6、因型攜帶者間胰島素原/胰島素比值的差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：本研究在重慶地區(qū)的漢族人群中證實(shí)了PCSK2的rs2021785位點(diǎn)SNPs和T2DM顯著相關(guān)，TCF7L2的rs7903146可能與早相胰島素分泌有關(guān)，但尚未發(fā)現(xiàn)TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951位點(diǎn)SNPs和T2DM的相關(guān)性，亦未發(fā)現(xiàn)以上SNPs位點(diǎn)與空腹胰島素原及胰島素原/胰島素比值的相關(guān)性。

7、
　　第二部分 TCF7L2的RNA干擾對(duì)胰島素原的影響及機(jī)制
　　目的：首先證實(shí)TCF7L2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子在前蛋白轉(zhuǎn)化酶基因的啟動(dòng)子上存在結(jié)合位點(diǎn)；其次探討TCF7L2干擾對(duì)胰島素原的影響及機(jī)制。
　　方法：通過體外培養(yǎng)Beta-TC-6細(xì)胞株，首先采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)證實(shí)TCF7L2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子在前蛋白轉(zhuǎn)化酶基因的啟動(dòng)子上存在結(jié)合位點(diǎn)；其次通過構(gòu)建TCF7L2的慢病毒干擾載體，下調(diào)TCF7L2的表

8、達(dá)，采用熒光定量PCR和Western Blotting方法檢測(cè)TCF7L2和前蛋白轉(zhuǎn)化酶基因mRNA及蛋白水平的變化，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA方法測(cè)定基礎(chǔ)和葡萄糖刺激狀態(tài)下胰島素和胰島素原水平的變化；最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TCF7L2干擾對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：1.ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Beta-TC-6細(xì)胞中TCF4抗體免疫沉淀的ChIP產(chǎn)物中能擴(kuò)增到PCSK1和PCSK2基因的啟動(dòng)子。
　　2.TCF7L

9、2慢病毒干擾載體的構(gòu)建及干擾效率的鑒定：酶切和測(cè)序均證實(shí)重組干擾質(zhì)粒核苷酸序列插入正確，流式細(xì)胞儀測(cè)定病毒平均滴度1.2×109IU/ml。慢病毒感染Beta-TC-6細(xì)胞48小時(shí)后，在熒光顯微鏡下觀察慢病毒感染效率達(dá)80％以上，TCF7L2干擾組TCF7L2無論是mRNA還是蛋白表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.05，n=3)。mRNA的干擾效率約為75％，蛋白水平的干擾率約為50％。
　　3.TCF7L2干擾對(duì)前蛋白轉(zhuǎn)化酶表達(dá)

10、和活性的影響：①TCF7L2表達(dá)下調(diào)后，PCSK1和PCSK2基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05，n=3)；②TCF7L2表達(dá)下調(diào)后，葡萄糖刺激的胰島素分泌顯著降低，而葡萄糖刺激后胰島素原分泌及胰島素原/胰島素比值顯著增加(P<0.05，n=3)，提示前蛋白轉(zhuǎn)化酶活性降低；③TCF7L2表達(dá)下調(diào)后，胰島β細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.05，n=5)。
　　結(jié)論：TCF7L2表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子在前蛋白轉(zhuǎn)化酶基因的啟動(dòng)子