具有靶向、pH響應(yīng)特性的硼替佐米新劑型的合成及其在骨腫瘤治療中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-Proteasome System，UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑之一。蛋白酶體內(nèi)存在多種調(diào)節(jié)蛋白參與細(xì)胞的生長、增殖、分化及凋亡，該系統(tǒng)活性過高導(dǎo)致的蛋白質(zhì)降解損傷可促進(jìn)一些包括腫瘤在內(nèi)的疾病的發(fā)生。而蛋白酶體抑制劑與蛋白酶體內(nèi)的酶解活性位點(diǎn)結(jié)合，能阻礙靶蛋白的降解，進(jìn)而影響細(xì)胞原有的增殖、分化和凋亡過程。硼替佐米(Bortezomib，BTZ)作為一個(gè)強(qiáng)效且特異性的蛋白酶

2、體抑制劑，通過硼酸基團(tuán)與蛋白酶體活性中心的蘇氨酸殘基結(jié)合從而抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白酶體，達(dá)到治療的目的。近年來硼替佐米在多發(fā)性骨髓瘤及套細(xì)胞淋巴瘤等腫瘤的治療中得到充分認(rèn)可，然而，由于其可非特異性的結(jié)合蛋白，在肝臟中快速被清除且組織滲透和聚集能力差等特點(diǎn)，對于實(shí)體腫瘤的抑制作用有限，且可造成嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，從而明顯限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，近年來國內(nèi)外許多學(xué)者研究以脂質(zhì)體包裹的納米凝膠、中空介孔氧化硅納米球、PALG納米粒等多種材料

3、為載體構(gòu)建BTZ的控釋系統(tǒng)，在一定程度上提升了BTZ的緩釋性能和生物相容性，延長了其在腫瘤局部的停留時(shí)間。但是，這些載體仍難以靶向輸送BTZ達(dá)到腫瘤部位，且難以在腫瘤部位快速釋放BTZ達(dá)到有效的藥物濃度。這既降低了納米載體藥物投送的效率，又對體內(nèi)的正常組織和器官造成毒副作用。因此，該研究課題旨在制備一種新型的納米載體，實(shí)現(xiàn)硼替佐米向腫瘤部位的主動(dòng)靶向輸送以并在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)性釋放，從而顯著提高硼替佐米的腫瘤抑制效應(yīng)，同時(shí)降低其毒副

4、作用。
　　方法：
　　以第5代聚酰胺-胺樹形高分子(G5 PAMAM)為基礎(chǔ)，合成cRGD序列肽和聚乙二醇(PEG)共同修飾的、連接鄰苯二酚基團(tuán)(Catechol)的納米載體cRGD-PEG-PAMAM-Cat。通過載體上含有的鄰苯二酚與硼酸基團(tuán)反應(yīng)生成硼酸酯鍵，從而合成cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ復(fù)合物，即硼替佐米的新劑型。進(jìn)一步用透析釋放法和1HNMR波譜法分析cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BT

5、Z復(fù)合物在不同pH條件下的體外釋放，并明確細(xì)胞對載體cRGD-PEG-PAMAM-Cat的攝取情況。在體外，以MTT實(shí)驗(yàn)來檢測cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ復(fù)合物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。最后，建立乳腺癌脛骨轉(zhuǎn)移的原位動(dòng)物模型，進(jìn)行治療:cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ復(fù)合物組（RGD+組），PEG-PAMAM-Cat/BTZ組（RGD-組），BTZ組和磷酸鹽緩沖溶液組（PBS組）。經(jīng)尾靜脈注射給藥治療，定期測量各

6、組裸鼠的體重，測量腫瘤周長變化。治療結(jié)束后，通過分析治療前后裸鼠脛骨腫瘤的生物熒光顯像，脛骨X線、Micro-CT，骨體積，骨小梁數(shù)量，腫瘤周長變化，裸鼠體重變化等數(shù)據(jù)，同時(shí)通過TUNEL染色及血常規(guī)檢測等，明確硼替佐米新劑型在體內(nèi)對腫瘤的抑制情況及其毒副作用的大小。
　　結(jié)果：
　　（一）具有靶向作用、pH響應(yīng)的樹形高分子納米載體的合成以及BTZ新劑型的制備
　　成功合成cRGD、PEG和鄰苯二酚基團(tuán)修飾的G5 PA

7、MAM載體(cRGD-PEG-PAMAM-Cat)。1H NMR光譜圖顯示，合成的樹形高分子載體上平均連接有36個(gè)PEG、2個(gè)cRGD及30個(gè)鄰苯二酚功能基團(tuán)。載體cRGD-PEG-PAMAM-Cat進(jìn)一步通過鄰苯二酚-硼酸鹽反應(yīng)形成的復(fù)合物，即cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ，也即為BTZ的新劑型。該BTZ新劑型在生理?xiàng)l件下(pH=7.4)具有很好的穩(wěn)定性。
　?。ǘヽRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ的體

8、外釋放、細(xì)胞攝取以及對腫瘤細(xì)胞的抑制作用
　　透析釋藥實(shí)驗(yàn)及1H NVR波譜法研究顯示，在pH=7.4時(shí)，cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ在12h時(shí)候的BTZ釋放量小于5％;隨著pH的降低，釋放速度加快。在pH=6.5時(shí)，3h的BTZ釋放量為30％，在pH=5.0時(shí)，3h的BTZ釋放量為52％。連接cRGD-PEG-PAMAM-Cat的芘硼酸大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而單純的芘硼酸則幾乎不進(jìn)入細(xì)胞，提示在cRGD與整合素結(jié)合后的

9、介導(dǎo)作用下，載體可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，cRGD-PEG-PAMAM-Cat/BTZ復(fù)合物對細(xì)胞有著明顯的毒性作用，且毒性作用隨著cRGD-PEG-PAMAM-Cat所復(fù)合BTZ比例的增高而增強(qiáng)，而未連接cRGD的PEG-PAMAM-Cat/BTZ未表現(xiàn)出明顯的毒性作用。
　?。ㄈ┤橄侔┟劰寝D(zhuǎn)移裸鼠模型的治療評(píng)估
　　各組裸鼠在治療前后體重未見明顯改變。治療前后各組裸鼠腫瘤的相對熒光量統(tǒng)計(jì)表明，RGD+組的相對熒光量

10、明顯弱于PBS組及RGD-組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。盡管RGD+組與BTZ組相比無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但RGD+組熒光量較BTZ組降低一倍左右。治療前后腫瘤最長周徑(Perimeter of tumor)大小變化顯示RGD組脛骨腫瘤周長較PBS組、RGD-組和BTZ組變化小，統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組裸鼠脛骨X線、Micro-CT均提示，RGD+組的骨質(zhì)破壞較其他各組更輕。進(jìn)一步對腫瘤破壞段脛骨進(jìn)行骨體積(

11、Bone volume)等的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果具有差異性（P＜0.05），充分說明RGD+組較其他各組具有明顯的腫瘤抑制、保護(hù)骨質(zhì)的作用。腫瘤的重量的結(jié)果也顯示RGD+組腫瘤低于其他各組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　我們成功合成了一種具有良好生物相容性的新型樹形高分子納米材料藥物載體。在cRGD輔助下，該載體不僅可實(shí)現(xiàn)靶向遞送藥物，而且可介導(dǎo)載體藥物復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。通過鄰苯二酚基團(tuán)與硼酸鹽形成硼酸酯鍵的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物的結(jié)合