運(yùn)動預(yù)適應(yīng)對力竭大鼠心肌TNF-α介導(dǎo)的凋亡通路的影響.pdf

1、目的：
　　力竭運(yùn)動可致心肌損傷，嚴(yán)重者發(fā)生猝死，這類事件并不少見，是運(yùn)動醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)面臨的共同課題。以往研究多集中在對力竭后心肌損傷的藥物治療，仍缺乏有效的預(yù)防措施。目前已公認(rèn)缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic preconditioning,IP）可通過反復(fù)多次短暫缺血使心臟在隨后持續(xù)的缺血損傷中得到保護(hù)，使人們從對細(xì)胞直接保護(hù)研究轉(zhuǎn)向?qū)?nèi)源性保護(hù)機(jī)制研究。運(yùn)動預(yù)適應(yīng)(exercise preconditioning,E

2、P)作為 IP的一種特殊形式，即通過運(yùn)動誘導(dǎo)機(jī)體的自身保護(hù)，從而提高心肌耐受缺血缺氧的能力。最近研究表明心肌細(xì)胞凋亡是力竭后心肌損傷的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，力竭運(yùn)動使Bax/Bcl-2比值增高，促進(jìn)Fas蛋白表達(dá)，決定心肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡的執(zhí)行期，繼而由TNF-α、NF-KB、Fas-L等引發(fā)一系列復(fù)雜的細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase

3、,Caspase）相關(guān)凋亡信號通路發(fā)揮重要作用。EP具有心肌保護(hù)作用，但EP是否通過抑制心肌細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮保護(hù)作用及其在心肌細(xì)胞凋亡時對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的影響尚不清楚。本研究擬在建立大鼠EP和力竭運(yùn)動損傷模型的基礎(chǔ)上，從細(xì)胞凋亡角度研究EP對心肌TNF-α和Caspase蛋白酶表達(dá)的影響，探討EP心肌保護(hù)效應(yīng)是否通過影響TNF-α介導(dǎo)的凋亡通路發(fā)揮作用，進(jìn)一步了解EP對心肌的保護(hù)作用的分子機(jī)制，同時為運(yùn)動預(yù)適應(yīng)對力竭后心肌損傷的防治

4、提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分成4組：安靜對照組、力竭運(yùn)動組、短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組、長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組（n=12）。除安靜對照組，其余各組以尾部負(fù)重大鼠3％體重的方式進(jìn)行游泳訓(xùn)練。安靜對照組：常規(guī)飼養(yǎng)3天，不游泳；力竭運(yùn)動組：參照Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)飼養(yǎng)3天后進(jìn)行一次游泳運(yùn)動，直至力竭。短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組：標(biāo)準(zhǔn)參照Lennon方法建立，每天進(jìn)行間歇性游泳運(yùn)動1次，每次1小時，要求游泳15分鐘

5、，休息5分鐘，重復(fù)3次，持續(xù)3天，然后與力竭組進(jìn)行一次力竭游泳運(yùn)動；長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組：參照Margonato方法建立，每天進(jìn)行間歇性游泳運(yùn)動1次，運(yùn)動方式同短期，持續(xù)3周（6天/周），然后進(jìn)行一次力竭游泳運(yùn)動。安靜對照組直接取材，各組于力竭運(yùn)動后30分鐘取材。
　　2.取大鼠心肌組織作病理切片，經(jīng)HE染色，光鏡下觀察其顯微結(jié)構(gòu)。
　　3.采用ELISA方法檢測血清中缺血修飾白蛋白（IMA）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣

6、蛋白I（cTnI）的含量。
　　4.采用DNA原位末端標(biāo)記（TUNEL）法觀察心肌細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。
　　5.采用熒光定量PCR方法檢測大鼠心肌組織中TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3基因的表達(dá)水平。
　　6.采用Western Blot方法檢測大鼠心肌組織中TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠心肌

7、顯微結(jié)構(gòu)安靜對照組心肌結(jié)構(gòu)完整，肌纖維排列整齊、無斷裂，間質(zhì)無水腫，可見橫紋；力竭組心肌細(xì)胞腫脹明顯，可見肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維增生、水腫；短期、長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組偶見肌纖維斷裂，輪廓較清楚，間質(zhì)水腫較輕，而且長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組相比于短期更接近對照組。
　　2.大鼠血清生化指標(biāo)比較（1）與安靜對照組相比，力竭組、短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組和長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組血清 IMA、CK-MB含量均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），力竭組和短期

8、運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組血清cTnI明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組升高不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）與力竭組相比，長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組血清IMA、CK-MB、cTnI含量均明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組血清CK-MB、cTnI明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而IMA下降不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況經(jīng)TUNEL染色后正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕色。結(jié)果顯示對照組

9、（13.17±3.43%）大鼠心肌組織存在少數(shù)散在的細(xì)胞凋亡；力竭組（44.38±6.13%）大鼠心肌組織出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，明顯高于對照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；短期（36.14±3.16%）、長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組（25.83±5.12%）與力竭組相比凋亡明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組較短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組減少更明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.心肌組織中TNF-α、Caspase-8、Cas

10、pase-9、Caspase-3mRNA的表達(dá)水平（1）與安靜對照組相比，除長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組的Caspase-9外，其余各組心肌 TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3mRNA表達(dá)量均明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。（2）與力竭組相比，除短期Caspase-3外，短期、長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3mRNA含量明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

11、P＜0.05）,長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組比短期下降更明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.心肌組織中TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白的表達(dá)水平（1）與安靜對照組相比，力竭組和短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組大鼠心肌TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3蛋白明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組升高不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）與力竭組相比，短期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組大

12、鼠心肌 TNF-α、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3下降不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而長期運(yùn)動預(yù)適應(yīng)組明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.力竭運(yùn)動可致心肌損傷,運(yùn)動預(yù)適應(yīng)可減輕力竭運(yùn)動后心肌損傷。
　　2.心肌細(xì)胞凋亡參與力竭運(yùn)動致心肌損傷的機(jī)制，力竭運(yùn)動激活TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路，上調(diào)Caspase蛋白酶，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。
　　3.運(yùn)動預(yù)適應(yīng)可通過抑