雌三醇抗體制備及快速檢測技術研究.pdf

1、雌三醇（E3）是一種內分泌干擾物質，即使在低濃度下也能發(fā)揮生物效應，它會干擾機體內分泌功能，引起內分泌失調，影響身體健康。近年來有報道不法商將雌激素應用于畜牧養(yǎng)殖，其危害已成為關注的焦點，國家也出臺了相應的法律法規(guī)，禁止雌三醇等雌激素在畜牧生產中的使用，但在經濟利益驅使下，濫用現(xiàn)象仍然時有發(fā)生。因此，加強對雌三醇等雌激素殘留的監(jiān)測和檢測十分必要。免疫的方法具體靈敏度高、特異性高、成本較低、快速簡便等特點，可以擴大食品的抽檢的覆蓋范圍，對

2、完善構建食品安全監(jiān)測體系和保障人民的生命健康具有重要意義。本研究以雌三醇為對象，在前期研究的基礎上進一步設計了新的免疫半抗原，制備多克隆抗體和單克隆抗體，同時建立ELISA及電化學傳感器的方法，以期滿足不同的檢測需求。主要內容與結果如下：
　　（1）半抗原合成與鑒定。針對原有雌三醇抗體靈敏度低的問題，結合雌三醇的結構特點，在酚羥基位置引入含有兩個碳原子的末端為羧基的間隔臂，設計合成新的免疫半抗原E3-A（雌三醇-3-羧甲基醚），經

3、質譜和核磁共振技術鑒定合成成功，將半抗原通過活潑脂法與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，經紫外吸收光譜鑒定偶聯(lián)成功。
　?。?）多克隆抗體的制備及高靈敏 icELSIA方法的建立。將新免疫原免疫新西蘭大白兔，制備獲得多克隆抗體，并建立 ELISA分析方法。研究了不同包被原條件下ELISA方法的特異性，結果表明異源包被直接影響方法檢測靈敏度以及抗體的特異性。在采用 E2-A-OVA包被時，ELISA方法對 E3的檢測限（IC10）=0.01

4、7 ng/mL，IC50=0.185ng/mL，線性范圍為0.041~0.837ng/mL，且對雌二醇沒有交叉反應，特異性高。將該方法用于奶制品樣品中雌三醇的檢測，結果表明回收率在85.0％~106.5%之間，具有良好的準確性。與HPLC-MS/MS方法檢測結果相關性良好（R2=0.973）。
　　（3）單克隆抗體的制備及一步電沉積免疫傳感器方法建立。為進一步保證抗體的良好來源，將免疫原免疫Balb/c小鼠，并取脾臟細胞與骨髓瘤細

5、胞融合，制備獲得一株穩(wěn)定分泌 E3單克隆抗體的細胞株 E3-2C2，體內培養(yǎng)制備鼠單克隆抗體mAb-E3-A-BSA，效價為1:64000，1μg/mL E3抑制率為95.2%?；趩慰寺】贵w建立電化學免疫傳感器方法。首先通過循環(huán)伏安法將普魯士藍-殼聚糖-納米金（PB-CS-AuNPs）修飾在玻碳電極表面，以增加電極的比表面積、導電性和生物親和性。通過納米金固定包被抗原，蛋白封閉后加入一抗和藥物，進行競爭免疫反應，加入二抗，形成包被抗原