黑莓花色苷降解與輔色及抗氧化活性研究.pdf

1、黑莓果實(shí)富含花色苷，具有抑制質(zhì)脂過(guò)氧化及清除自由基活性、降低血清膽固醇及中性脂肪、抗變異及抗腫瘤作用、改善肝功能及改善視力等諸多醫(yī)療和保健功能，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。本文以黑莓為試材，研究了果膠酶和果漿復(fù)合酶聯(lián)合酶解制備黑莓澄清汁;解析了黑莓花色苷結(jié)構(gòu)，研究了黑莓汁花色苷熱穩(wěn)定性，分析了黑莓花色苷單體降解規(guī)律;比較了有機(jī)酸對(duì)水體系中黑莓花色苷輔色效果，以及對(duì)黑莓花色苷熱穩(wěn)定性、色澤及抗氧化活性影響，研究輔色前后黑莓花色

2、苷變化規(guī)律;在明確黑莓花色苷結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，研究了黑莓花色苷體外清除自由基能力、黑莓花色苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞H2O2誘導(dǎo)損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果如下:
　　 1.采用果膠酶和果漿復(fù)合酶聯(lián)合處理黑莓，通過(guò)響應(yīng)面分析法對(duì)黑莓澄清汁制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:加酶量對(duì)黑莓出汁率影響極顯著，加酶量和溫度交互作用極顯著(P＜0.01)。溫度和時(shí)間、加酶量和時(shí)間的交互作用不顯著。在果膠酶與果漿復(fù)合酶的酶活比為1∶1、加酶量0.13％、溫度43℃、

3、時(shí)間酶解2.5h的條件下，黑莓出汁率達(dá)到79.5％，比對(duì)照提高75.8％。
　　 2.采用不同類(lèi)型樹(shù)脂分離黑莓汁中花色苷，用凝膠柱層析進(jìn)一步純化黑莓花色苷，利用HPLC-ESI-MS對(duì)純化組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。結(jié)果表明:大孔樹(shù)脂AB-8分離黑莓花色苷效果好，最佳分離條件為:溫度為25℃、吸附平衡時(shí)間為4h、解吸平衡時(shí)間為3h;解吸時(shí)宜選用體積分?jǐn)?shù)75％乙醇溶液;上樣速率為2BV/h，上樣體積1100ml粗提液，3BV體積分?jǐn)?shù)為75％

4、乙醇，以1BV/h洗脫速率洗脫。此條件下花色苷得率為1.22％、回收率75.45％、純度86.50％。
　　 Sephadex LH-20純化黑莓花色苷時(shí)，用流速0.6ml/mim為40％、60％和80％乙醇（含0.01％HCl）分步洗脫，得到2個(gè)混合花色苷組分。HPLC-ESI-MS分析表明，組分2主要成分為矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷和矢車(chē)菊-3-O-阿拉伯糖苷、矢車(chē)菊3-O-丙二酸酐酰葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷

5、，組分1中還檢測(cè)到1種矢車(chē)菊衍生物。
　　 3.黑莓汁花色苷及單體花色苷降解規(guī)律及其抗氧化活性的研究結(jié)果表明:在溫度70～90℃和pH2.0～4.0下黑莓花色苷降解遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，花色苷的降解速率隨溫度和pH升高而增加。黑莓花色苷在pH2.0、3.0和4.0時(shí)的活化能（Ea）分別為40.09、28.80和28.71 kJ mol-1，pH2.0時(shí)的半衰期（T1/2）分別為6.19h、4.28 h和2.97 h，提示低溫和

6、低pH有利于保持黑莓花色苷的穩(wěn)定性。
　　 黑莓中4種花色苷單體的降解均遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，Ea、T1/2和反應(yīng)速率常數(shù)(k)不同，且差異顯著(P＜0.05)。在溫度70、80和90℃時(shí)，矢車(chē)菊-3-O-草酸酐酰葡萄糖苷的T1/2分別為9.48、6.83和3.54h，矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷的T1/2分別為9.04、6.62和3.09h。矢車(chē)菊-3-O-丙二酸酐酰葡萄糖苷的T1/2與矢車(chē)菊-3-O-阿拉伯糖苷接近，提示花色苷

7、的結(jié)構(gòu)影響其穩(wěn)定性。相同條件下，矢車(chē)菊色素衍生物濃度隨溫度升高呈上升趨勢(shì)，表明降解后的花色苷與有機(jī)酸反應(yīng)生成了衍生物。溫度對(duì)黑莓花色苷顯著影響抗氧化性，花色苷降解與抗氧化活性高度相關(guān)。
　　 4.研究了有機(jī)酸對(duì)黑莓花色苷純化物在水體系中的熱穩(wěn)定性、色澤及抗氧化活性的影響。結(jié)果表明:蘋(píng)果酸、丙二酸和草酸顯著增加黑莓花色苷吸光度(P＜0.05)，并具有濃度效應(yīng)，其中以草酸增色效果最為顯著，其次是丙二酸和蘋(píng)果酸，阿魏酸、咖啡酸和單寧酸

8、對(duì)黑莓花色苷的增色效果不顯著。黑莓花色苷溶液經(jīng)蘋(píng)果酸、丙二酸和草酸輔色后L*值隨酸濃度增大而減小，a*、b*和h值隨蘋(píng)果酸、丙二酸和草酸濃度的增大而增加，輔色劑濃度達(dá)到0.09mol/L時(shí)輔色效果最佳。
　　 經(jīng)蘋(píng)果酸、丙二酸和草酸輔色后的黑莓花色苷活化能Ea(P＜0.05)均得到顯著提高，其中草酸顯著提高黑莓花色苷的熱穩(wěn)定性，Ea提高86％。經(jīng)蘋(píng)果酸、丙二酸和草酸對(duì)黑莓花色苷輔色后T1/2顯著高于對(duì)照(P＜0.05)。在70℃

9、、80和90℃條件下，經(jīng)草酸輔色的T1/2分別為34.15、18.48和10.12h，顯著高于對(duì)照組的19.04、14.87和9.89h。黑莓花色苷輔色后的L*值隨加熱溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，a*值呈下降趨勢(shì)，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。輔色劑可顯著減緩黑莓花色苷色澤的降解速率，其中草酸輔色效果最好。經(jīng)草酸輔色的黑莓花色苷成分與輔色前相比，未發(fā)生變化，推測(cè)草酸與黑莓花色苷的輔色作用為分子間非共價(jià)鍵輔色。
　　 在三

10、種抗氧化體系中，黑莓花色苷的總抗氧化力隨草酸輔色時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降后升的趨勢(shì)，清除超氧陰離子能力和清除羥自由基能力則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。濃度為0.04 mol/L草酸輔色2h，黑莓花色苷的總抗氧化能力達(dá)到最大值(68.72 U/ml);濃度為0.08 mol/L草酸輔色3h，黑莓花色苷清除羥自由基和超氧陰離子能力分別達(dá)到22.37U/ml和446.13U/L，顯著高于輔色前的15.32 U/ml和350U/L（P＜0.05）。
　　

11、 5.比較了黑莓花色苷體外清除自由基活性的能力，研究其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、存活率和MDA含量的影響，對(duì)抗氧化酶系的調(diào)節(jié)與細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，探討黑莓花色苷的抗氧化作用機(jī)理。結(jié)果表明，在20～100μg/ml濃度范圍內(nèi)，黑莓花色苷清除DPPH能力與濃度呈顯著正相關(guān)，但低于同濃度的抗壞血酸，而抑制羥自由基能力顯著高于后者。
　　 細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)收縮、變圓、體積變小，細(xì)胞間隙增寬，大部分細(xì)胞破碎、

12、脫落，用不同劑量的黑莓花色苷預(yù)處理均對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的保護(hù)作用，細(xì)胞形態(tài)比損傷組有所改善。采用MTT法考察了黑莓花色苷預(yù)處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響。濃度為50～200μg/ml黑莓花色苷處理12h時(shí)，用1.0mmol/L的H2O2處理12h，細(xì)胞存活率由106％升至157％，顯著降低H2O2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用（P＜0.01）;抗壞血酸保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的效果不顯著。隨著黑莓花色苷濃度的增加，細(xì)胞MDA水平顯著降低（P＜0.0

13、5）且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系;抗壞血酸處理組與H2O2損傷組之間差異不顯著。用黑莓花色苷預(yù)處理可提高細(xì)胞POD、SOD和 GSH-ST活性，且隨濃度增加而升高，其中200μg/ml處理組的POD提高80％。用50～200μg/ml黑莓花色苷預(yù)處理時(shí)，細(xì)胞早期凋亡率由70.58％降為11.26％，晚期凋亡率由7.53％到2.01％。這表明黑莓花色苷通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物、提高細(xì)胞抗氧化酶活性、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡和抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)導(dǎo)致的血管內(nèi)