植物乳桿菌降膽固醇突變株的構建與初步研究.pdf

1、本實驗室從西藏傳統(tǒng)的乳制品Kefir粒當中分離獲得一株具有高效降膽固醇能力的植物乳桿菌MA2，該菌株具有良好的發(fā)酵特性和益生功能，其膽固醇移除率最高可達45％，是一株在功能性食品領域有著廣闊應用前景的菌株。
　　以植物孚乳桿菌MA2為研究對象，對其膽固醇移除率影響因素膽固醇添加濃度、菌體生長狀態(tài)、菌體濃度與存活狀態(tài)以及膽鹽添加進行了探究。采用Mμ轉座子隨機插入的誘變方法，經(jīng)過電轉化將Mμ轉座復合物誘導連入植物乳桿菌MA2基因組中，

2、對其降膽固醇功能表型改變進行初步篩選研究。通過Mμ轉座子插入的方法，篩選降膽固醇能力顯著改變的突變株，若其插入位點是相關負調控基因，則其降膽固醇能力上升;若插入位點是直接調控降膽固醇的基因或者是相關正調控基因，則其降膽固醇能力下降。
　　通過構建含Mμ轉座子的大腸桿菌重組質粒pUC18，經(jīng)重組質粒提取、酶切、切膠回收、濃縮，使其濃度達到實驗所需濃度標準，成功制備Mμ轉座復合物。利用優(yōu)化好的電轉化條件，細胞生長至OD600nm≈0.

3、5時制備感受態(tài)，恢復培養(yǎng)基蔗糖添加終濃度為0.1 mol/L，恢復培養(yǎng)時間為2h，在2 kV，25μF，電阻200Ω條件下，對其進行電轉化，將Mμ轉座復合物導入植物乳桿菌MA2基因組。經(jīng)5μg/mL氯霉素抗性平板初步篩選獲取突變株，提取突變株基因組提取，利用轉座序列上氯霉素抗性基因設計特異性引物進行PCR擴增，驗證突變株中Mμ轉座子片段，構建突變子庫，其結果顯示在660bp處有明亮特異性條帶，共獲得166個突變子。
　　利用改良的

4、鄰苯二甲醛法對166個突變株進行膽固醇移除率測定，結果顯示，與野生菌MA2相比，99號和163號突變子膽固醇移除率顯著下降，分別為22.5％和32.3％，表明該突變子Mμ轉座子插入位點基因為降膽固醇功能直接基因或者其相關正調控基因，相關基因被破壞，其降膽固醇能力相應下降。獲得的其他突變子膽固醇移除率與野生菌MA2基本一致，表明其Mμ轉座子插入位點基因與降膽固醇功能并不相關。以上研究結果為后續(xù)分離轉座子插入的側翼序列，從分子生物學角度研究