希臘魏斯菌D1501抑菌物質(zhì)研究及其作為保護性發(fā)酵劑在新型豆腐中的應(yīng)用.pdf

1、食品在加工、生產(chǎn)、運輸、儲藏和銷售過程中，極易受到腐敗菌和致病菌的污染，而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。食品變質(zhì)不僅會造成巨大的經(jīng)濟損失和環(huán)境污染等問題，同時還會嚴(yán)重危害人類的健康。隨著生活水平的提高和科學(xué)技術(shù)的進步，食品安全問題日益受到消費者的關(guān)注，綠色和健康的食品為大眾所推崇，因而將安全、高效、天然的食品防腐保鮮劑應(yīng)用到食品工業(yè)中勢在必行。乳酸菌是公認的、安全的微生物和益生菌，將其廣泛應(yīng)用到許多食品的發(fā)酵中已具有幾千年的歷史。乳酸菌代謝產(chǎn)生有機酸、

2、過氧化氫、CO2和細菌素等，通過不同的作用機制抑制其他微生物的生長，延長食品的保質(zhì)期，保證食品的品質(zhì)和安全。此外，乳酸菌及其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物與人類健康息息相關(guān)。因此，將乳酸菌及其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于食品防腐保鮮中已成為食品防腐保鮮研究與開發(fā)的熱點。
　　本論文從多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的148株乳酸菌出發(fā)，篩選得到一株具有廣譜抑菌活性的希臘魏斯菌D1501;確定其在中性發(fā)酵上清液中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)類細菌素，然后采用多種傳

3、統(tǒng)分離方法和色譜分離技術(shù)聯(lián)用對細菌素進行分離和純化，并利用MALDI-TOF-MS、N端測序和肽指紋圖譜(PMF)進行鑒定;此外對細菌素的理化穩(wěn)定性和抑菌譜進行研究;希臘魏斯菌D1501除產(chǎn)生細菌素外，還能產(chǎn)生廣譜抑菌活性的非蛋白質(zhì)類物質(zhì)一苯乳酸和羥基苯乳酸，并通過Plackett-Burman試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗設(shè)計，使二者產(chǎn)量均得到顯著提高;由于希臘魏斯菌D1501具有廣譜抑菌性，所以將其作為保護性發(fā)酵劑和新型豆腐生物凝固劑，開發(fā)

4、出一種新型長保質(zhì)期的活性乳酸菌豆腐。為開發(fā)新型天然乳酸菌防腐保鮮劑及乳酸菌作為保護性發(fā)酵劑在食品保鮮中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.廣譜抑菌活性乳酸菌的篩選及發(fā)酵特性的研究
　　利用瓊脂擴散法，對本實驗室從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的148株乳酸菌的抑菌特性進行研究。通過初篩和排除酸干擾的復(fù)篩，最終篩選出一株具有廣譜抑菌活性的菌株D1501。菌株D1501是本實驗室已鑒定乳酸菌，為希臘魏斯菌（Weissella he

5、llenica）。通過單因素實驗確定當(dāng)在起始pH6.0的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為3％(v/v)，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)24 h時，希臘魏斯菌D1501中性發(fā)酵上清液的抑菌活性達到最高。
　　2.細菌素weissellicinD的分離、純化和鑒定
　　希臘魏斯菌D1501中性發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感，確定其為蛋白質(zhì)類的細菌素物質(zhì)，并命名為weissellicin D。采用硫酸銨分級沉淀、Superdex75pg分

6、子篩凝膠過濾和Mono-Q離子交換對weissellicin D進行分離和純化。利用Tricine-SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS確定細菌素的分子量為62425 Da，是目前已報道的魏斯菌屬所產(chǎn)生的細菌素中分子量最大的。利用Edman降解法發(fā)現(xiàn)細菌素weissellicin D的N端封閉。利用肽質(zhì)量指紋圖譜法(PMF)對細菌素一級結(jié)構(gòu)進行鑒定，細菌素weissellicin D被胰酶水解后的所有肽段信息在NCBInr數(shù)據(jù)庫中

7、沒有得到完全匹配。而細菌素weissellicin D和Lactobacillus ultunensis DSM16047的ABC超家族ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白的匹配度最高，但蛋白質(zhì)覆蓋率只有19％。因此，希臘魏斯菌D1501產(chǎn)生的細菌素weissellicin D是一個具有特殊結(jié)構(gòu)且未被報道的新型乳酸菌細菌素。
　　3.細菌素weisselliein D的理化特性、抑菌譜和抑菌特性
　　細菌素weissellicin D在pH2

8、.0-8.0范圍內(nèi)均具有抑菌活性。細菌素weisselliein D具有良好的熱穩(wěn)定性，在121℃高壓滅菌15 min后仍具有抑菌活性。紫外照射對細菌素活性也無影響。不同化學(xué)物質(zhì)（甲醇、乙醇、吐溫-80、SDS、尿素和EDTA）對細菌素weissellicinD的抑菌活性沒有影響，其中EDTA的添加能夠顯著提高抑菌活性。細菌素weissellicin D對多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌均有抑菌活性，具有廣譜抑菌譜。細菌素we

9、issellicin D對大腸桿菌K-12的作用方式是抑菌方式，細菌素產(chǎn)生菌希臘魏斯菌D1501能夠有效地和大腸桿菌K-12發(fā)生共絮凝。當(dāng)希臘魏斯菌D1501和大腸桿菌K-12共培養(yǎng)時，希臘魏斯菌D1501能夠有效地抑制大腸桿菌K-12的生長，同時促使細菌素提前產(chǎn)生。
　　4.希臘魏斯菌D1501產(chǎn)非蛋白類抑菌物質(zhì)的研究
　　希臘魏斯菌D1501在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24 h，苯乳酸的產(chǎn)量為128.31mg/L(0.

10、77 mM)，羥基苯乳酸的產(chǎn)量為48.94 mg/L(0.27 mM)，是目前報道的魏斯菌屬中產(chǎn)量最高的。從希臘魏斯菌D1501發(fā)酵液提取的苯乳酸和羥基苯乳酸的粗提液，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和蠟樣芽胞桿菌均具有顯著的抑制作用。利用PB試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗設(shè)計優(yōu)化苯乳酸和羥基苯乳酸的產(chǎn)量:當(dāng)培養(yǎng)基組成為葡萄糖46 g/L、蛋白胨23g/L、酵母膏5g/L、牛肉膏10 g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸銨2g/L

11、、K2HPO4·3H2O2.62 g/L、MgSO4·7H2O0.58 g/L、MnSO4·H2O0.198 g/L、吐溫-801.0 mL/L，苯丙酮酸6.5 g/L、色氨酸1g/L，起始pH8.0，30℃培養(yǎng)108 h后，苯乳酸和羥基苯乳酸的產(chǎn)量均達到最高，分別為2.40 g/L(14.46M)和242.95 mg/L(1.34 mM)，對比優(yōu)化前分別提高了18.70倍和4.96倍。
　　5.D1501作為保護性發(fā)酵劑在新型乳

12、酸菌豆腐中的應(yīng)用
　　將希臘魏斯菌D1501和吉氏庫特氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別在豆?jié){中共同培養(yǎng)，希臘魏斯菌D1501及其代謝產(chǎn)物能夠有效地抑制三種腐敗菌和致病菌的生長，并且36h后檢測不到這三株菌。
　　通過單因素實驗并結(jié)合感官評定，最終確定新型乳酸菌豆腐的制作工藝為豆水比1∶8，希臘魏斯菌D1501的接種量為4％(v/v)，MTG添加量為200U/L，培養(yǎng)溫度為37℃，在此條件下，乳酸菌豆腐色澤乳白，表面光滑，質(zhì)

13、地柔軟且富有彈性。對比傳統(tǒng)凝固劑制作的豆腐和乳酸菌豆腐在不同溫度下儲藏時細菌總數(shù)的變化情況，結(jié)果表明乳酸菌豆腐中的希臘魏斯菌D1501能夠抑制雜菌的污染，從而延長乳酸菌豆腐的保質(zhì)期。在37℃下儲藏7d、25℃下儲藏14d和4℃儲藏21 d，乳酸菌豆腐的理化指標(biāo)（pH、滴定酸度、持水力和質(zhì)構(gòu)）和乳酸菌活菌數(shù)的變化相對穩(wěn)定。同時在儲藏過程中，有機酸、多種具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)和細菌素類似物等不斷產(chǎn)生，有效阻止腐敗菌的生長，進一步確保了乳酸