棉花泛素結合酶基因GhUBC2L的功能驗證及棉花CRISPR-Cas9系統(tǒng)的構建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、蛋白質泛素化修飾是細胞生命活動必不可少的生化過程,被泛素分子標記的蛋白往往獲得不同的命運:改變生化活性或者是被蛋白酶體降解。E2泛素結合酶是蛋白質泛素化修飾過程的關鍵酶之一,它與E3一起決定底物特異性,給底物添加泛素蛋白,維護泛素鏈形成的持續(xù)性,選擇泛素鏈的連接方式和決定泛素鏈的長短,因此發(fā)揮著重要作用。植物E2蛋白家族成員眾多,相關功能報道主要集中在擬南芥中,它們廣泛參與植物的光形態(tài)建成、生殖和生長發(fā)育、花期調控以及各種生物或非生物逆

2、境響應等過程,但是在重要經濟作物棉花中鮮有報道。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來快速發(fā)展的基因組編輯技術,它能夠實現基因的定點編輯,因更具高效性和靈活性而廣受研究者青睞。目前該技術的主要應用是創(chuàng)造特定基因的突變體,然而棉花中很少有突變體材料用于功能基因的遺傳研究,因此在棉花中創(chuàng)建CRISPR/Cas9系統(tǒng)能加快棉花基因功能的研究進展。
  本研究主要內容分為兩部分,分別探討棉花E2基因Gh UBC2L的基因功能以及在棉花中創(chuàng)建C

3、RISPR/Cas9系統(tǒng),主要結果如下:
  一、E2基因GhUBC2L參與調控棉花的器官發(fā)育
  1.我們在棉花中克隆到一個注釋為E2泛素結合酶的基因GhUBC2L,核酸和蛋白序列比對發(fā)現該基因與AtUBC1和AtUBC2高度同源。體外酶活實驗驗證該基因編碼的蛋白具有泛素結合酶活性,亞細胞定位結果顯示它在細胞內所有位置表達。
  2.在棉花中對GhUBC2L分別進行超表達和RNAi干涉,獲得的基因干涉植株表現為植株生

4、長變緩,包括葉片、花和成熟種子在內的器官變小,纖維發(fā)育也受阻,超表達植株的葉片和花器官明顯增大。細胞水平檢測發(fā)現,GhUBC2L可能通過調控細胞的增殖和膨大來決定器官的大小。
  3.通過酵母雙雜交實驗,篩選到與GhUBC2L互作的蛋白GhUbox8,體內和體外實驗證實兩者發(fā)生互作。體外酶活實驗證實GhUbox8具有E3泛素連接酶活性,同時自身能夠-形成二聚體。檢測轉基因材料間的組蛋白修飾狀態(tài),發(fā)現干涉植株中H2Bub和H3K4m

5、e3修飾水平均顯著下降,H2Bub水平下調格外明顯,但是還沒有建立GhUbox8與組蛋白修飾的聯(lián)系。
  4.對關鍵基因表達量檢測,發(fā)現JA合成關鍵基因LOX1,發(fā)育相關基因MADS1在干涉中顯著下調。最后推測,GhUBC2L可能與包括GhUbox8在內的多個E3連接酶互作,參與不同組蛋白的泛素化修飾,調控關鍵的發(fā)育相關基因的表達,從而調控棉花的正常生長發(fā)育。
  二、棉花中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的建立
  1.我

6、們在棉花中克隆到與擬南芥AtU6-26同源的U6啟動子,用于改造能夠同時串聯(lián)多個sgRNA靶標的CRISPR/Cas9表達載體。分別對棉花中異源表達的基因DsRED2和棉花內源基因GhCLA1設計多個sgRNA打靶位點,構建載體并進行棉花遺傳轉化。
  2.靶向DsRED2的6個sgRNA位點均能夠被編輯,編輯類型以堿基缺失為主。DsRED2基因被敲除的棉花在各個組織中均丟失了紅色熒光,紅色種子也恢復成野生型狀態(tài)。遺傳分析發(fā)現,T

7、0代產生的突變基因型和表型均能夠穩(wěn)定遺傳至T1代,而且對沒突變的位點能產生持續(xù)編輯。
  3.靶向GhCLA1的4個sgRNA位點均能夠被編輯,編輯類型以堿基缺失為主。載體上的兩個sgRNA能夠同時作用于目的基因,并產生大片段缺失。GhCLA1基因被敲除后產生明顯的白化植株,生長發(fā)育受到嚴重的影響,該表型產生效率達到75%。通過分析多個單株的靶標位點基因型和表型發(fā)現,產生完全白化的表型需要敲除GhCLA1的所有拷貝。
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