尿液exosomes的分離、富集、純化及其內(nèi)部蛋白指紋圖譜分析.pdf

1、研究背景:
　　1987年，Johnstone等在研究網(wǎng)織紅細胞的成熟過程中，通過羊網(wǎng)織紅細胞體外培養(yǎng)的上清超速離心后，收集到一種直徑60 nm的囊性小泡，其將這些納米級的小囊泡即命名為exosomes。exosomes由脂質(zhì)雙分子層、跨膜蛋白、mRNAs和microRNAs組成，密度在1.13ug/ml到1.19g/ml之問，在電子顯微鏡下呈杯狀。
　　近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，尿液exosomes蛋白譜的變化可以反映某些特定

2、的腎臟病變情況。Exosomes可以攜帶信息穿梭于腎臟細胞之問，改變受體細胞蛋白譜與功能，這可能代表著一種腎單位內(nèi)細胞與細胞間的信號傳遞機制。
　　近年來結(jié)合尿exosomes分離技術(shù)及先進的蛋白質(zhì)組學技術(shù)已經(jīng)檢測出不少腎臟結(jié)構(gòu)與功能損害相關(guān)的尿exosomes生物標記物。尿液exosomes的發(fā)現(xiàn)對糖尿病腎病發(fā)病機制、早期診斷和監(jiān)測標記物的研究帶來了新的方向。
　　尿液exosomes給腎臟病等泌尿系統(tǒng)疾病的研究帶來了極大

3、的前景，但日前還處于初期階段，很多研究中面臨的問題與挑戰(zhàn)有待解決。
　　首當其沖的就是尿液exosomes的分離、富集和純化問題。到目前為止還沒有統(tǒng)一的得到一致認可的標準方法。
　　本研究團隊經(jīng)過兩年的前期研究創(chuàng)立了一種新的exosomes分離、富集方法-“液壓透析法(hydrostatic dialysis)”。該方法具有設(shè)備簡單、成本低、處理量大，尿液中干擾性的可溶性蛋白有效清除，排除個體間exosomes外其它因素差異

4、對后續(xù)生物學分析的影響（如不同尿液來源的酸堿程度差異在本方法處理后處在同一PH水平），最大程度減少了exosomes的損失，而且可以與超速離心、超濾方法上述兩種分離、富集方法相結(jié)合用于不同目的的研究等主要優(yōu)點。該方法在大規(guī)模推廣應(yīng)用前需要進一步通過中國人群不同腎病程度的尿液標本來驗證該方法的可重復性與有效性。另外我們將在此方法分離、富集尿液exosomes基礎(chǔ)上探討可作為尿液exosomes成分標準化的候選指標。同時，進一步應(yīng)用還原、烷

5、基化、Trypsin酶解等方法探索對尿液exosomes的完全純化（即完全清除exosomes外的干擾蛋白）。在純化的尿液exosomes基礎(chǔ)上，通過質(zhì)譜分析了解尿液exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。
　　方法:
　　1.尿液標本的選取與收集
　　“液壓透析法”驗證研究標本從-80℃超低溫冰箱所保存的中國人群尿液樣本庫中選取，包括正常人群組、前驅(qū)糖尿病組、糖尿病無蛋白尿組、糖尿病微量白蛋白尿組、糖尿病大量蛋白尿組尿液樣

6、本。
　　標準化、純化及質(zhì)譜分析研究選取都柏林城市大學健康志愿者提供的尿液標本。所有入組對象均簽署經(jīng)都柏林城市大學國家生物傳感器中心倫理委員會批準的知情同意書。收集研究對象晨起第一次尿液樣本，不添加蛋白酶抑制劑及防腐劑，2小時內(nèi)送實驗室處理。
　　2.“液壓透析法”尿exosomes的分離、富集
　　尿液標本先室溫下2000g離心30分鐘，除去細胞、細胞碎片、及部分Tamm-Horsfall蛋白。上清液通過白行設(shè)計的液

7、壓透析裝置進行exosomes分離、富集:檢查裝置連接良好后，將尿液標本倒入該裝置，待樣品濃縮至6-8ml時，加入200ml miliQ水，沖洗1000KD透析膜。待樣品進一步濃縮至6-8ml時收集1000KD透析膜內(nèi)的液體(↑1000KDa fraction)。
　　3.尿exosomes的鑒定
　　透射電子顯微鏡觀察“液壓透析法”分離、富集的↑1000KDa部分液體中是否存在囊泡，囊泡的形狀、大小。通過western b

8、lot檢測尿exosomes自身的標記物TSG101。
　　4.探討尿液exosomes相關(guān)標準化（量化）指標
　　探討Tamm-Horsfall蛋白以及白蛋白這兩種指標在尿液exosomes相關(guān)檢測結(jié)果標準化的應(yīng)用可行性。10位健康人尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)，通過western blot技術(shù)在同一塊膜上檢測Tamm-Horsfall蛋白與TSG101蛋白熒光信號以及白蛋白與TSG

9、101蛋白熒光信號，利用Odyssey掃描系統(tǒng)自帶的軟件定量分析熒光信號強度。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包對10份樣品的灰度值數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。應(yīng)用Spearman秩相關(guān)系數(shù)來分析THP與TSG101灰度值，以及Albumin與TSG101灰度值之間的相關(guān)關(guān)系，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除
　　Tamm-Horsfall蛋白的多聚體結(jié)構(gòu)中富含二硫鍵。利

10、用還原與烷基化試劑對二硫鍵破壞，觀察其對尿液exosoems外部干擾蛋白（特別是Tamm-Horsfall蛋白的降解與清除情況）以及對exosomes的影響，為exosomes的純化研究提供指導。
　　6.Trypsin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化
　　對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品(↑1000KDa)進行還原、烷基化及蛋白酶Trypsin酶解反應(yīng)。將外部的蛋白

11、（特別是Tamm-Horsfall蛋白）分解成肽段，再經(jīng)過截留分子量為30KD的超濾裝置進行分離。利用凝膠考馬斯亮藍染色、western blot及透射電鏡觀察Tamm-Horsfall蛋白的分解及清除情況，以及對exosomes本身的影響。
　　7.在尿液exosomes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析
　　對尿液“液壓透析法”富集的尿液exosomes樣品，利用上述方法進行exosomes純化。然后使

12、用去污劑脫氧膽酸鈉破壞exosomes外膜，暴露exosomes內(nèi)部成分，再進行還原、烷基化及Trypsin酶解蛋白，利用質(zhì)譜分析了解exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜。
　　結(jié)果:
　　1.新型尿液exosomes分離、富集技術(shù)的驗證
　　中國人群不同腎臟病變程度尿液樣品通過“液壓透析法”均可有效分離、富集exosomes，體現(xiàn)了很好的重復性和穩(wěn)定性。透射電鏡下可以觀察到↑1000KDa樣品中散在分布的大小不等的囊泡，

13、囊泡主要的直徑范圍為40-100nm，最小的囊泡直徑為20-30nm，最大的囊泡直徑可為400nm。Western blot檢測到exosomes自身的標記物TSG101陽性，表明尿exosomes富集過程中exosomes未受到破壞。
　　2.尿液exosomes相關(guān)標準化（量化）指標
　　通過Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描后的圖像通過Quantity-One圖像分析軟件掃描計算出條帶平均灰度值。Spearman秩

14、相關(guān)系數(shù)的分析結(jié)果顯示Tamm-Horsfall蛋白與TSG101熒光強度相關(guān)系數(shù)r=0.842，p=0.002，兩者之間具有正相關(guān)關(guān)系。
　　3.還原與烷基化反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除
　　凝膠考馬斯亮藍染色及western blot結(jié)果顯示，還原與烷基化反應(yīng)后exosomes外Tamm-Horsfall蛋白部分降解，但兩種還原及烷基化試劑在不同速度離心下均不能完全消除Tamm-Horsfall蛋白對ex

15、osomes的影響。
　　4.Trypsin酶解反應(yīng)對尿液exosomes外部干擾蛋白的去除及exosomes的純化
　　凝膠考馬斯亮藍染色及western blot結(jié)果顯示，還原、烷基化基礎(chǔ)上的Trypsin酶解反應(yīng)，可將exosomes外Tamm-Horsfall蛋白完全降解。通過截留分子量為30KD的超濾裝置可清除已降解的肽段，實現(xiàn)exosomes的純化。整個過程中exosome未受到破環(huán)。
　　5.在尿液exo

16、somes純化的基礎(chǔ)上對exosomes內(nèi)部蛋白指紋圖譜的分析
　　在上述純化的exosomes的基礎(chǔ)上，對exosomes內(nèi)部成分進行MS/MS分析，結(jié)果共鑒定出exosomes內(nèi)部942種蛋白質(zhì)并對鑒定的蛋白進行了細胞組分、分子功能與生物過程的分析。
　　結(jié)論:
　　1.本研究團隊所發(fā)明的“液壓透析法”能夠很好地分離、富集尿液中的exosomes，有著良好的重復性和穩(wěn)定性，適用于不同的實驗室、不同的人群以及不同的尿

17、液病理狀態(tài)，是一種值得廣泛推廣應(yīng)用的技術(shù)方法。
　　2.Tamm-Horsfall蛋白可以作為檢測尿液exosomes相關(guān)生物標記物的候選標準化（量化）指標。
　　3.應(yīng)用還原、烷基化及Trypsin酶解反應(yīng)結(jié)合超濾裝置能實現(xiàn)尿液exosomes的純化，再此基礎(chǔ)上鑒定可靠的exosomes內(nèi)部蛋白質(zhì)圖譜。
　　4.本研究建立了一套從尿液收集，到尿液exosomes分離、富集、純化及蛋白質(zhì)組學分析的一體化研究方法，為后續(xù)