新型羥醛縮合酶的發(fā)現(xiàn)及性質(zhì)研究.pdf

1、羥醛縮合反應(yīng)能形成新的C-C鍵，在合成有機(jī)化學(xué)中占有重要地位，在工業(yè)中具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在利用基因挖礦手段獲得新型羥醛縮合酶基因，在大腸桿菌中表達(dá)、純化，并研究它們的催化性能，探索它們?cè)谏锎呋铣梢恍┲匾幬镏虚g體中的應(yīng)用。
　　通過基因挖礦獲得了Staphylococcushominis來源的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶基因(shnal，AccessionNo.EFS20452.1)，將其構(gòu)建至pET-28a質(zhì)粒并在大腸

2、桿菌中得到表達(dá)，對(duì)目的蛋白進(jìn)行了純化。通過對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，ShNAL為四聚體，裂解方向的最適反應(yīng)pH為8.0;合成方向的最適反應(yīng)pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為45℃。在45℃下孵育2h對(duì)ShNAL的活力基本無影響，高于45℃時(shí)，活力迅速下降。該酶在pH5.0-10.0的環(huán)境中比較穩(wěn)定，4℃下放置24h酶的殘余活力在70％以上。ShNAL對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分別是

3、(4.0±0.2)mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L，kcat/Km值分別為1.9L/mmol·s、0.08L/mmol·s和0.08L/mmol·s。由ShNAL催化的N-乙酰甘露糖胺與丙酮酸的縮合反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了91.5％，產(chǎn)率達(dá)到了89.4％。通過ShNAL和N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶的串聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了從N-乙酰葡萄糖胺到N-乙酰神經(jīng)氨酸的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了30％左右。同時(shí)也對(duì)得到的來

4、源于Blastopirellulamarina的N-乙酰神經(jīng)氨酸裂合酶BmNAL(GenBankAccessionNo.ZP_01092134.1)進(jìn)行構(gòu)建和表達(dá)，對(duì)其酶活性質(zhì)進(jìn)行了鑒定。
　　通過基因比對(duì)和挖礦技術(shù)我們還得到兩個(gè)蘇氨酸醛縮酶，分別來自Deinococcusdeserti(DdTA)和Hoefleaphototrophica(HpTA)，基因信息來自Genbank(AccessionNo.分別為YP_0027855