植物乳桿菌ZJ316細(xì)菌素合成調(diào)控基因plnC和plnD表達(dá)及蛋白純化.pdf

1、植物乳桿菌是一種在泡菜、酸奶及動(dòng)物胃腸道中等發(fā)現(xiàn)的能廣泛利用植物性碳源、耐受膽鹽和低pH的乳酸桿菌。有些植物乳桿菌能產(chǎn)生Ⅱ類細(xì)菌素，對(duì)大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌有抑制作用。植物乳桿菌產(chǎn)生的Ⅱ類細(xì)菌素由天然氨基酸組成，轉(zhuǎn)錄后不修飾，是熱穩(wěn)定的疏水肽，該類細(xì)菌素的合成受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)控制。
　　 課題組從健康嬰兒糞便中分離得到的植物乳桿菌ZJ316能產(chǎn)大小約為4.0KD的細(xì)菌素，本研究克隆了ZJ316中調(diào)控細(xì)菌素合成

2、的群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorumsensing，QS)，并對(duì)QS中起調(diào)節(jié)作用的plnC和plnD基因(調(diào)節(jié)因子，RR)做了初步探析，內(nèi)容包括:
　　 (1)通過(guò)Genbank獲取與植物乳桿菌編碼QS相關(guān)基因序列，設(shè)計(jì)引物，以植物乳桿菌ZJ316基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，ZJ316中存在編碼群體感應(yīng)系統(tǒng)的plnABCD操縱子。并對(duì)plnC和plnD基因編碼合成的PlnC和PlnD蛋白進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)

3、和空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，PlnC和PlnD蛋白結(jié)構(gòu)相似，且都是通過(guò)與DNA特定位點(diǎn)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)其各自功能。
　　 (2)將plnC和plnD基因分別克隆到原核表達(dá)載體pET-32a-SUMO中，構(gòu)建pET-plnC和pET-plnD重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果表明，重組蛋白在Kana濃度100μg/mL、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時(shí)間3h、IPTG濃度0.2mM的條件下進(jìn)行表達(dá)，SDS-PAGE

4、表明表達(dá)的重組蛋白皆以包涵體形式存在。
　　 (3)將超聲破碎后的茵液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行初次純化，平衡緩沖液為20mMPBS、500mMNaCl、20mM咪唑、pH8.0，洗脫緩沖液為20mMPBS、500mMNaCl、150～300mM咪唑、pH8.0;包涵體復(fù)性后，再利用Ni-NTA親和層析和G200葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行純化復(fù)性后目標(biāo)蛋白，得到純度較高的目標(biāo)蛋白;之后用SUMO酶切，并用DEAE離子交換柱脫鹽純化目