植物乳桿菌ZJ316細菌素合成調(diào)控基因plnC和plnD表達及蛋白純化.pdf

1、植物乳桿菌是一種在泡菜、酸奶及動物胃腸道中等發(fā)現(xiàn)的能廣泛利用植物性碳源、耐受膽鹽和低pH的乳酸桿菌。有些植物乳桿菌能產(chǎn)生Ⅱ類細菌素，對大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌有抑制作用。植物乳桿菌產(chǎn)生的Ⅱ類細菌素由天然氨基酸組成，轉錄后不修飾，是熱穩(wěn)定的疏水肽，該類細菌素的合成受群體感應系統(tǒng)調(diào)節(jié)控制。
　　 課題組從健康嬰兒糞便中分離得到的植物乳桿菌ZJ316能產(chǎn)大小約為4.0KD的細菌素，本研究克隆了ZJ316中調(diào)控細菌素合成

2、的群體感應系統(tǒng)(Quorumsensing，QS)，并對QS中起調(diào)節(jié)作用的plnC和plnD基因(調(diào)節(jié)因子，RR)做了初步探析，內(nèi)容包括:
　　 (1)通過Genbank獲取與植物乳桿菌編碼QS相關基因序列，設計引物，以植物乳桿菌ZJ316基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結果顯示，ZJ316中存在編碼群體感應系統(tǒng)的plnABCD操縱子。并對plnC和plnD基因編碼合成的PlnC和PlnD蛋白進行一級結構、理化性質(zhì)、二級結構

3、和空間結構的預測，結果顯示，PlnC和PlnD蛋白結構相似，且都是通過與DNA特定位點的結合實現(xiàn)其各自功能。
　　 (2)將plnC和plnD基因分別克隆到原核表達載體pET-32a-SUMO中，構建pET-plnC和pET-plnD重組質(zhì)粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導表達。結果表明，重組蛋白在Kana濃度100μg/mL、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間3h、IPTG濃度0.2mM的條件下進行表達，SDS-PAGE

4、表明表達的重組蛋白皆以包涵體形式存在。
　　 (3)將超聲破碎后的茵液經(jīng)Ni-NTA親和層析柱進行初次純化，平衡緩沖液為20mMPBS、500mMNaCl、20mM咪唑、pH8.0，洗脫緩沖液為20mMPBS、500mMNaCl、150～300mM咪唑、pH8.0;包涵體復性后，再利用Ni-NTA親和層析和G200葡聚糖凝膠柱層析進行純化復性后目標蛋白，得到純度較高的目標蛋白;之后用SUMO酶切，并用DEAE離子交換柱脫鹽純化目