新型植物乳桿菌細(xì)菌素PZJ5的分離純化及特性研究.pdf

1、防腐劑是食品工業(yè)中最重要的添加劑之一，使用防腐劑是防止食品變質(zhì)的有效方法。目前我國(guó)大量使用的還是化學(xué)防腐劑，存在食品安全隱患。Nisin是世界公認(rèn)安全的天然食品防腐劑;但Nisin抗菌譜較窄，只能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母菌、霉菌及病毒無(wú)抑制作用。植物乳桿菌素(Plantaricin)是由植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)產(chǎn)生的一種耐高、低溫、耐酸、在人體中可降解、安全無(wú)毒，且具有較強(qiáng)抑菌活性的抗

2、菌短肽。本實(shí)驗(yàn)室已分離到一株對(duì)典型革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性食品腐敗菌均具有抑制作用的植物乳桿菌，本研究確定發(fā)揮抗菌作用的為肽類物質(zhì)PZJ5，并進(jìn)一步研究了PZJ5的分離純化、理化特性、基因克隆及生物學(xué)信息、合成條件優(yōu)化等因素。獲得主要試驗(yàn)結(jié)果如下：
　?、旁谒嵝詶l件(pH≤5)下，細(xì)菌素PZJ5對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯的抑菌作用。PZJ5具有較好的熱穩(wěn)定性。該細(xì)菌素對(duì)胃蛋白酶非常敏感，胰蛋白酶、蛋白酶K均可使PZJ5抑菌

3、活性降低。
　?、瓢l(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨梯度沉淀、離子交換色譜、疏水層析和凝膠色譜純化后，PZJ5得到了較好的分離，出現(xiàn)了單獨(dú)活力峰，表明該細(xì)菌素樣品已經(jīng)達(dá)到了單一組分。經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定PZJ5的分子量為2573.8 Da，采用Edman法進(jìn)行N端測(cè)序，獲得了PZJ5的氨基酸序列:KTKQQFLIKAQTQLFKVFGYTLKK。
　　⑶通過(guò)對(duì)細(xì)菌素作用后的指示菌恢復(fù)生長(zhǎng)情況觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素PZJ5的作用模式為殺菌。通過(guò)透射電鏡和掃描

4、電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素PZJ5通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞壁成孔或破裂，使指示菌細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，從而細(xì)胞代謝無(wú)法正常進(jìn)行，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。通過(guò)測(cè)定指示菌細(xì)胞內(nèi)K+和核物質(zhì)的泄露，發(fā)現(xiàn)乳酸菌素PZJ5可在極短的時(shí)間使指示菌菌體破裂，細(xì)菌內(nèi)容物大量外泄，導(dǎo)致菌體死亡。
　?、冉?jīng)基因克隆和測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)PZJ5的成熟肽氨基酸全序列為22個(gè)氨基酸殘基:KTKQQFLIKAQTQLFKVFGYTL，在其N端還有一段信號(hào)肽序列:MSLVKENKTLVDELI

5、AQITFGG。通過(guò)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PZJ5是一種新的乳酸菌細(xì)菌素。經(jīng)生物信息學(xué)分析，PZJ5成熟肽帶有4個(gè)正電荷氨基酸，并且在第3位到第18位殘基的位置上組成了一個(gè)兩親α-螺旋結(jié)構(gòu)，符合膜作用原理。
　　(5)通過(guò)對(duì)不同培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分等因素的研究，采用PB試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件。得到最佳產(chǎn)PZJ5條件為葡萄糖2.00％，酵母提取物為1.02％，接種量為2.06％。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，植物乳桿菌ZJ5所產(chǎn)細(xì)菌素的效價(jià)從未優(yōu)化