人子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接及其蛋白在胚胎著床中的作用及調(diào)節(jié)機制研究.pdf

1、研究背景：人類的受精卵僅約一半能發(fā)育到妊娠20周后，而其中70-80％的失敗歸因于著床失敗。胚胎著床失敗是早期妊娠丟失的主要原因。盡管IVF-ET及其相關(guān)技術(shù)取得了很大進展，胚胎著床仍是決定妊娠率的主要環(huán)節(jié)。然而人類對胚胎著床分子機制的認識遠遠落后于對其它生殖過程的認識。IVF及其衍生技術(shù)中，促卵泡發(fā)育理論和藥物幾經(jīng)更新，然而對促進胚胎著床、改善子宮內(nèi)膜容受性方面幾無良策。
　　 人類分泌中期的子官內(nèi)膜在雌孕激素以及各種生長因子

2、、細胞因子、粘附分子組成的網(wǎng)絡系統(tǒng)精細調(diào)控下表現(xiàn)為對胚泡最大的容受性，這一時期也稱為胚泡著床窗口期。在這一時期子宮內(nèi)膜上皮細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)上都經(jīng)歷了重大的改變以適應胚泡的侵入。子宮內(nèi)膜上皮包括腔上皮和腺上皮，兩者都是由極性的單層立方上皮細胞構(gòu)成，但是兩者在胚胎著床窗口期形態(tài)和功能出現(xiàn)了不同的變化。容受期宮腔上皮出現(xiàn)細胞極性的下降：細胞高度下降，微絨毛消失，并由胞飲突取代，細胞表面電荷減少，細胞表面粘附分子分布由基側(cè)膜轉(zhuǎn)向頂側(cè)膜。容受期腺

3、上皮細胞則細胞高度增加，表現(xiàn)為最大的分泌活性和細胞極性。兩種細胞在胚胎著床中有不同的作用，宮腔上皮與胚泡發(fā)生接觸、粘附，子宮腺體的分泌為圍著床期以及早期妊娠的胚胎的發(fā)育提供“蛋白乳”的作用。
　　 緊密連接是上皮細胞最富特征性的結(jié)構(gòu)，也是上皮細胞屏障功能和維持細胞極性、調(diào)節(jié)細胞旁小分子物質(zhì)通透性的重要結(jié)構(gòu)，由多種穿膜蛋白組成。其中Occludin是第一個被發(fā)現(xiàn)的TJ組成蛋白，其生物學作用表現(xiàn)為多樣性，除了調(diào)節(jié)緊密連接的屏障功能外

4、還可能參與細胞增生與分化。
　　 緊密連接及其蛋白組成在人容受期與非容受期子宮內(nèi)膜宮腔上皮細胞和腺上皮細胞是否發(fā)生了變化？緊密連接蛋白Occludin是否受到性激素的調(diào)節(jié)，是否參與了子宮內(nèi)膜上皮細胞的生物學功能？這一系列問題至今尚未見報道，本課題針對上述問題進行了研究和探索。
　　 第一部分：月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接形態(tài)學及其蛋白組成研究
　　 目的：檢測月經(jīng)周期人子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)及其組成

5、蛋白Occludin、Zo-1、claudin-1，-2，-3，-4，-5的定位和定量表達
　　 方法：透射電鏡檢查人正常子宮內(nèi)膜宮腔上皮細胞和腺上皮細胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)在月經(jīng)周期中的變化；免疫熒光和免疫印跡法檢測TJ組成蛋白Occludin、Zo-1、claudin-1、-2、-3、-4、-5在人子宮內(nèi)膜上皮細胞中的定位與分布、表達量的周期性變化。
　　 結(jié)果：透射電鏡研究結(jié)果顯示人子宮內(nèi)膜宮腔上皮細胞緊密連接在分泌中

6、期比增生中晚期淺、寬；而子宮內(nèi)膜腺上皮細胞中分泌中期緊密連接比增生中晚期深、復雜、更加多的分支。共聚焦免疫熒光顯微鏡檢查提示子宮內(nèi)膜宮腔上皮細胞緊密連接蛋白Occludin，Zo-1表達在增生中晚期信號明顯強于分泌中期，熒光定量統(tǒng)計分析兩者有顯著差異。子宮內(nèi)膜腺上皮細胞Occludin,Zo-1的表達趨勢與腔上皮細胞剛好相反，在分泌中期信號明顯強于增生中晚期，熒光定量統(tǒng)計分析兩者有顯著差異。所有檢測的緊密連接蛋白Occludin、Zo-

7、1、claudin-1、-2、-3、-4、-5均可在分泌中期的腺上皮細胞膜頂端表達；在增生中晚期腺上皮細胞claudin-2、5表達陰性，claudin-1、-3在側(cè)基底膜表達；Occludin、Zo-1除了在細胞頂端外還在胞漿、側(cè)基底膜不連續(xù)表達。子宮內(nèi)膜組織western blot分析在分泌中期Occludin、claudin-1，-3，-4蛋白表達為最高峰。
　　 結(jié)論：人子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接及其組成蛋白在月經(jīng)周期呈周

8、期性變化。其中宮腔上皮細胞分泌中期緊密連接及其組成蛋白下調(diào)；腺上皮細胞緊密連接及其蛋白表達上調(diào)
　　 第二部分：子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接及其蛋白Occludin在胚泡粘附中的作用
　　 目的：明確子宮內(nèi)膜上皮細胞緊密連接在子宮內(nèi)膜與滋養(yǎng)細胞粘附中的調(diào)節(jié)作用
　　 方法：用透射電鏡、蛋白免疫印跡法、免疫熒光化學法、跨膜上皮細胞電阻(TER)檢測非容受性子宮內(nèi)膜上皮細胞HECI-A細胞和容受性子宮內(nèi)膜上皮細胞RL95

9、-2細胞在TJ形態(tài)、功能、TJ蛋白組成和分布的差異；利用子宮內(nèi)膜上皮細胞株-滋養(yǎng)細胞球(JAR spheroids)粘附的胚胎著床模型檢測兩種子宮內(nèi)膜上皮細胞胚泡粘附率的差異；對滋養(yǎng)細胞球進行活細胞熒光染料標記，利用雙色免疫熒光共聚焦顯微鏡檢測在HEC-1A細胞與滋養(yǎng)細胞球發(fā)生粘附處TJ蛋白Occludin表達的變化；觀察HECl-A細胞Occludin siRNA干擾后檢測TJ功能、胚泡粘附率的變化；檢測著床促進因子白細胞介素β-1對

10、HEC-1A細胞TJ蛋白Occludin和胚泡粘附率的調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)果：透射電鏡顯示HEC-1A細胞具有極性，緊密連接位于細胞頂端，免疫熒光染色顯示TJ蛋白Occludin、Zo-1表達于細胞膜。RL95-2細胞無TJ結(jié)構(gòu)，Occludin、Zo-1表達于細胞漿。Westem blot結(jié)果顯示HEC-1A細胞Zo-1，Occludin蛋白表達顯著高于RL95-2細胞。而Claudin-4在HEC-1A細胞陽性表達，RL95-2

11、細胞中陰性表達。HEC-1A細胞TER為(163.0±23.0)Ω×cm2，RL95-2細胞TER為(92.3±11.0)Ω×cm2，兩者相比有顯著差異(P<0.001)。HEC-1A細胞與JAR spheroids粘附率顯著低于RL95-2細胞。在JAR細胞球粘附處，HEC-1A細胞Occludin呈現(xiàn)為不連續(xù)、點狀分布。對HEC-1A細胞的Occludin經(jīng)siRNA干擾后，細胞在TJ重裝過程中TER峰值下降。白細胞介素1-β下調(diào)H

12、ECI-A細胞Occludin表達，并上調(diào)HECl-A細胞胚泡粘附率。
　　 結(jié)論：非容受性子宮內(nèi)膜上皮細胞HEC-1A存在功能性的緊密連接。HEC-1A細胞TJ蛋白Occludin下調(diào)后能夠促進子宮內(nèi)膜上皮細胞與胚泡的粘附；在JAR細胞球粘附處，HEC-1A細胞的緊密連接蛋白Occludin為不連續(xù)的點狀分布。本研究提示緊密連接蛋白Occludin下調(diào)參與子宮內(nèi)膜容受性的建立。
　　 第三部分：Occludin表達的性

13、激素調(diào)控及其在子宮內(nèi)膜腺上皮細胞增生和分泌中的作用
　　 目的：明確子宮內(nèi)膜上皮細胞Occludin表達的性激素調(diào)控；闡明Occludin在子宮內(nèi)膜上皮細胞增生和分泌中的作用。
　　 方法：雌激素、雌孕激素聯(lián)合培養(yǎng)增生期子宮內(nèi)膜腺上皮細胞。Westem blot檢測上皮細胞Occludin、Claudin-4的表達。以IK細胞為腺上皮細胞模型，對其Occludin進行siRNA基因干擾，采用流式細胞技術(shù)檢測細胞對凋亡誘導

14、劑H2O2的敏感性，通過細胞周期檢測細胞的增殖率；并采用蒽酮法檢測細胞糖原含量的變化。
　　 結(jié)果：孕激素上調(diào)65kD Occludin、Claudin-4表達；對IK細胞Occludin基因干擾后，細胞凋亡敏感性下降；細胞增殖率增加；糖原分泌下降。
　　 結(jié)論：孕激素上調(diào)TJ蛋白65kD Occludin、Claudin-4表達，提示孕激素能增強TJ功能。Occludin能夠抑制子宮內(nèi)膜上皮細胞的增生，并促進其分泌。提