基于靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的新型非核苷類HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性研究.pdf

1、人類免疫缺陷病毒(HIV)是導(dǎo)致傳染性疾病獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病，AIDS)的病原體。在HIV復(fù)制循環(huán)中，其自身的多功能性蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，負(fù)責(zé)完成RNA依賴的DNA合成、RNA的水解以及DNA依賴的DNA合成等多個(gè)中心環(huán)節(jié)。因此，以RT作為藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)來(lái)防治艾滋病具有抑制活性高、選擇性好、毒副作用小等優(yōu)勢(shì)，是目前研發(fā)抗HIV/AIDS藥物的重要策略。根據(jù)抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶作用機(jī)制及化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，其抑制

2、劑主要可分為核苷（酸）(nucleos(t)ide reverse transcriptase inhibitors，N(t)RTIs)和非核苷(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)兩類。其中，NNRTIs的作用機(jī)制是特異性結(jié)合于距離RT催化活性中心10(A)的變構(gòu)性口袋(NNIBP)，進(jìn)而導(dǎo)致RT重要功能的喪失來(lái)抑制病毒的復(fù)制。由于其結(jié)合的特異性，NNRTIs通

3、常具有高效、低毒的優(yōu)點(diǎn)，因而已成為HAART的重要組成部分。
　　芳基巰乙酰胺類HIV-1 NNRTIs的研究。本論文第二章選取了抗HIV-1特別是突變株活性較高的芳基巰乙酰胺類HIV-1 NNRTIs作為結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物。對(duì)該類抑制劑與靶點(diǎn)的作用模式特征及初步構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了深入的分析。在本課題組前期研究基礎(chǔ)上，根據(jù)生物電子等排、骨架躍遷等藥物設(shè)計(jì)原理先后設(shè)計(jì)合成了3個(gè)系列（系列Ⅱa，Ⅱb和Ⅱc）共66個(gè)芳基巰乙酰胺類HIV-

4、1NNRTIs，并對(duì)其進(jìn)行了體外抗HIV活性及抑酶活性研究。
　　首先以文獻(xiàn)報(bào)道的三唑巰乙酰胺類和本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的活性較好的噻二唑類及三嗪類巰乙酰胺HIV-1 NNRTIs為先導(dǎo)化合物，根據(jù)此類NNRTIs與靶點(diǎn)結(jié)合模式特征，采用生物電子等排體(Bioisosterism)藥物設(shè)計(jì)原理，用嘧啶環(huán)替代先導(dǎo)化合物中的三嗪環(huán)，三氮唑環(huán)部分替換酰胺鍵設(shè)計(jì)了嘧啶巰乙酰胺HIV-1 NNRTIs(系列Ⅱa);同時(shí)基于靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，利用骨架

5、躍遷的藥物設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了體積更大的吡啶并咪唑環(huán)作為骨架區(qū)的新型吡啶并咪唑類巰乙酰類HIV-1 NNRTIs(系列Ⅱb)。體外抗HIV活性結(jié)果顯示，系列Ⅱa和系列Ⅱb大部分化合物對(duì)HIV-1都具有較為明顯的抑制作用。系列Ⅱa中化合物的EC50值在微摩爾到亞微摩爾水平。
　　在對(duì)以上兩個(gè)系列芳基巰乙酰胺類化合物的研究基礎(chǔ)上，特別是系列Ⅱb，我們得出了初步的構(gòu)效關(guān)系并對(duì)靶點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)有了更深入的認(rèn)識(shí)。鑒于系列Ⅱb結(jié)構(gòu)的新穎性和活性結(jié)果總

6、結(jié)的初步結(jié)論，我們對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計(jì)了新的系列Ⅱc。在新設(shè)計(jì)的分子中，為探尋稠合環(huán)氮原子的最佳位置，咪唑并[4,5-b]吡啶環(huán)被選作為新的骨架作用區(qū)，同時(shí)采用了RDEA806的環(huán)丙基萘結(jié)構(gòu)作為芳香區(qū)以提高與保守氨基酸W229的作用，保留酰胺鏈并在部分化合物中引入甲基以適當(dāng)限制鏈的柔性。對(duì)酰胺鏈末端芳環(huán)的取代基采用不同基團(tuán)以完善構(gòu)效關(guān)系。體外抗HIV活性測(cè)試顯示大部分化合物對(duì)野生型HIV-1具有中等到較好的抑制作用?；钚宰詈?/p>

7、的兩個(gè)化合物Ⅱc-12和Ⅱc-13的EC50值分別為0.059μM和0.073μM，遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于對(duì)照藥物NVP(0.26μM)，且與DLV(0.038μM)活性相當(dāng)。其它大部分化合物都具有亞微摩爾活性(Ⅱc-8,Ⅱc-9,Ⅱc-11,Ⅱc-15,Ⅱc-16,Ⅱc-17,Ⅱc-20-25)，與NVP相當(dāng)。與上個(gè)系列Ⅱb相比，系列Ⅱc的抗野生型HIV-1活性有明顯的提高，表明進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化具有合理性。
　　新型DAPY類HIV-1 NN

8、RTIs的研究。本論文第三章以二芳基嘧啶(DAPY)類HIV-1 NNRTIs為研究對(duì)象。以上市藥物TMC125為先導(dǎo)化合物，通過(guò)晶體學(xué)和分子模擬等研究結(jié)果，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)合成一系列新型DAPY類HIV-1NNRTIs（系列Ⅲa，共28個(gè)化合物），后續(xù)的生物活性測(cè)試表現(xiàn)出了較好的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)要求，本論文進(jìn)一步對(duì)系列Ⅲa化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)合成了系列Ⅲb，共15個(gè)化合物。
　　對(duì)TMC125與RT復(fù)合物的

9、晶體學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TMC125中心嘧啶環(huán)1-位的氮原子位于NNIBP中連續(xù)的賴氨酸序列(K101-K104)周圍，并且與賴氨酸序列之間存在著較大的空間距離。因而在該位置上引入一些延伸的氫鍵供體或受體可能與周圍的賴氨酸序列產(chǎn)生更緊密的氫鍵作用。基于該分析，設(shè)計(jì)了系列Ⅲa化合物，即在保持DAPY類基本藥效團(tuán)的前提下，保留了中心嘧啶環(huán)并且在5-位延伸了結(jié)構(gòu)多樣的含氮基團(tuán)，作為氫鍵的受體或供體以探索與周圍氨基酸的相互作用。同時(shí)在左臂選取了結(jié)構(gòu)多樣

10、的活性取代基以進(jìn)一步探討該區(qū)域的構(gòu)效關(guān)系。系列Ⅲa的化合物都顯示出了明顯的抗野生型HIV-1活性，且部分化合物抑制活性較為突出，達(dá)到納摩爾水平。其中，Ⅲa-6和Ⅲa-10活性最好，EC50值分別為2.5 nM和7.2nM，SI為13740和1432,優(yōu)于所有的陽(yáng)性對(duì)照NVP、DLV、EFV、AZT和3TC。此外Ⅲa-5、Ⅲa-7、Ⅲa-9、Ⅲa-11、Ⅲa-14、Ⅲa-15、Ⅲa-18、Ⅲa-19、Ⅲa-21、Ⅲa-22、Ⅲa-23、Ⅲ

11、a-26、Ⅲa-30等多個(gè)化合物的EC50值在23-66 nM之間，均優(yōu)于NVP、DLV和3TC。同時(shí)Ⅲa-6還對(duì)K103N/Y181C HIV-1雙突變株保持中等抑制活性(EC50=0.33μM，SI=107)。而除了Ⅲa-26和Ⅲa-27外，其余R2基團(tuán)為NH2和NHCOCF3對(duì)雙突變病毒株都具有一定的抑制活性。特別意外的是，化合物Ⅲa-15和Ⅲa-23還表現(xiàn)出了中等程度的HIV-2抑制活性，EC50值分別為5μM和36μM，提示它

12、們可能有不同于經(jīng)典的NNRTIs的抗HIV作用機(jī)制。
　　在系列Ⅲa的活性指導(dǎo)下，并結(jié)合N-芐基取代哌啶類HIV-1 NNRTIs的研究進(jìn)展，對(duì)系列Ⅲa化合物右側(cè)進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造設(shè)計(jì)了新系列Ⅲb。其左臂采用Ⅲa中優(yōu)勢(shì)的2,6-二甲基-4-氰基苯酚或2,4,6-三甲基苯酚結(jié)構(gòu)。而右側(cè)的改造主要包括兩個(gè)方面:(1)在保留系列Ⅲa中嘧啶5位氨基的同時(shí)通過(guò)含雜原子的芳環(huán)（取代的吡啶胺）和N-取代芐基哌啶的引入以建立與周圍氨基酸的潛在氫鍵作用，

13、并發(fā)揮改善水溶性的作用;(2)在Ⅲa系列的基礎(chǔ)上，對(duì)嘧啶5-位的含氮基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)多樣性探討，根據(jù)系列Ⅲa得出的此結(jié)合部位氫鍵供體要好于受體的初步結(jié)論，一些胍基、硫脲等被引入以進(jìn)一步探討該位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基團(tuán)?；钚越Y(jié)果表明，N-取代芐基哌啶的引入使化合物保持了較高的抗野生型HIV活性，同時(shí)對(duì)突變病毒株的活性有所提高。Ⅲb-20活性最好，EC50值分別為2.6 nM(ⅢB)和180nM(RES056)，SI為16345和74(RES056)，優(yōu)于

14、陽(yáng)性對(duì)照藥物NVP、DLV和EFV。而右臂引入含雜原子的芳環(huán)（取代的吡啶胺）或?qū)Π被男揎検够钚云毡榻档?。?duì)Ⅲb系列代表化合物Ⅲb-17和Ⅲb-20溶解度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示這兩個(gè)化合物較上市藥物依曲偉林的溶解度有顯著提高，克服了已有上市藥物的的缺陷，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。
　　吲哚芳砜類HIV-1 NNRTIs的研究。本論文第四章是在對(duì)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)和吲哚芳砜類HIV-1 NNRTIs與RT結(jié)合模式充分分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一系列針對(duì)第二

15、通道的新型吲哚芳砜類衍生物（系列Ⅳa），共24個(gè)化合物。
　　系列Ⅳa化合物基本保持了吲哚芳砜類HIV-1 NNRTIs的結(jié)構(gòu)骨架和優(yōu)勢(shì)基團(tuán)。主要的結(jié)構(gòu)改造區(qū)域?yàn)槲挥诘诙ǖ赖腄區(qū)域。在DAPY類HIV-1NNRTIs部分已述及其右臂位于NNIBP中另一個(gè)蛋白溶劑的開口區(qū)（第一通道），而在該類化合物的結(jié)構(gòu)改造中發(fā)現(xiàn)在此處引入N-取代哌啶基團(tuán)不但能形成額外的氫鍵作用，且大大地改善了水溶性。因此，我們運(yùn)用骨架躍遷的藥物設(shè)計(jì)原理將DAP

16、Y類HIV-1 NNRTIs的N-取代哌啶基團(tuán)引入到吲哚芳砜骨架中，希望增加作用力的同時(shí)提高水溶性。體外抗HIV活性實(shí)驗(yàn)顯示所有系列IVa的化合物都具有顯著的的抗野生型HIV-1作用，EC50值范圍為0.62μM到0.006μM。并且大部分化合物對(duì)多種單突變株也顯示出了良好的抑制作用，如變異病毒株L100I、K103N、Y181C、E138K。該系列中化合物Ⅳa-8'和Ⅳa-12活性較為突出，對(duì)野生型HIV-1的EC50值分別為6nM和

17、9nM，SI為1005和1476。
　　綜上，本論文基于HIV-1 RT的三維結(jié)構(gòu)，以及NNRTIs與RT復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)生物學(xué)信息，根據(jù)芳基巰乙酰胺類、DAPY類和吲哚芳砜類HIV-1 NNRTIs的各自結(jié)合模式及藥效團(tuán)特征，利用“骨架躍遷”、“生物電子等排”和“優(yōu)勢(shì)藥效團(tuán)的組合”等經(jīng)典藥物設(shè)計(jì)原理，對(duì)三類HIV-1 NNRTIs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理的修飾，設(shè)計(jì)6個(gè)系列結(jié)構(gòu)全新的化合物，同時(shí)運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行分子模擬以驗(yàn)證

18、設(shè)計(jì)的合理性。并通過(guò)定向合成得到了133個(gè)全新結(jié)構(gòu)的化合物，生物活性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，多個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物抗野生HIV-1活性為微摩爾到納摩爾水平，并且Ⅲa-6、Ⅲb-14、Ⅲb-15、Ⅲb-17、Ⅲb-18、Ⅲb-19、Ⅲb-20和Ⅳa-14對(duì)K103N/Y181C HIV-1雙突變株保持有摩爾或亞微摩爾抑制活性，優(yōu)于現(xiàn)有上市藥物NVP、DLV和EFV等，具有進(jìn)一步研發(fā)的價(jià)值。總之，本論文豐富和發(fā)展了三大類NNRTIs的構(gòu)效關(guān)系，獲得了一批具有高