姜根莖中植源性凝乳酶的分離純化、特性研究及其在奶酪生產(chǎn)中的應(yīng)用.pdf

1、奶酪在人類(lèi)飲食中有著悠久的歷史。在古代，奶酪是牛奶延長(zhǎng)貨架期的一種主要產(chǎn)品形式。奶酪中的高脂肪和高蛋白讓它成為一種高能量和富含營(yíng)養(yǎng)的食物。如今，奶酪消費(fèi)廣泛分布在世界各地。凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中一種最主要的活性劑。在凝乳酶的制備中，小牛皺胃酶是第一個(gè)，也是目前應(yīng)用最廣泛的。
　　 奶酪生產(chǎn)在世界范圍內(nèi)廣泛增加，但隨著小牛皺胃酶供應(yīng)的減少、宗教原因(例如，伊斯蘭教和猶太教)、飲食(素食主義)以及禁令基因重組小牛皺胃酶(在法國(guó)、德國(guó)和荷

2、蘭)，使得對(duì)牛奶凝乳酶替代品有了更大的需求。通過(guò)基因工程細(xì)菌和霉菌生產(chǎn)的微生物皺胃酶已經(jīng)被證明適合作為動(dòng)物皺胃酶的替代品，但更令我們感興趣的是一些植物來(lái)源的天然皺胃酶。
　　 由于動(dòng)物皺胃酶的使用受到限制，所以植物凝乳酶的使用有助于提高這些人對(duì)于奶酪的生產(chǎn)。雖然一些植物來(lái)源的蛋白水解酶能夠凝乳，但可惜的是用于生產(chǎn)奶酪的大部分植物皺胃酶的使用被認(rèn)為是不恰當(dāng)?shù)?，因?yàn)樗倪^(guò)度水解特性會(huì)降低奶酪最后的產(chǎn)量，同時(shí)也由于這種方式生產(chǎn)的奶酪最

3、后會(huì)產(chǎn)生苦澀的口味，因而也限制了其使用。隨后，為了滿(mǎn)足工業(yè)良性增長(zhǎng)以及順應(yīng)全球?qū)Χ嘣獌?yōu)質(zhì)的奶酪生產(chǎn)需求，從植物中提取新的牛奶蛋白凝乳酶的探索仍然在繼續(xù)。
　　 該研究報(bào)告主要內(nèi)容包括：(1)優(yōu)化牛奶凝乳劑--姜蛋白酶的萃取條件，(2)從姜的根莖得到的新型牛奶凝乳劑--半胱氨酸蛋白酶的特性和純化，(3)姜蛋白酶、木瓜蛋白酶和小牛皺胃酶對(duì)牛奶凝乳的影響，(4)在奶酪的生產(chǎn)過(guò)程中利用姜蛋白酶和小牛皺胃酶進(jìn)行蛋白水解，(5)用姜蛋白酶和

4、小牛皺胃酶制備的Peshawari奶酪的物理化學(xué)、微生物和感官特性評(píng)價(jià)。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)工藝參數(shù)的優(yōu)化。即均質(zhì)時(shí)間(1-3 min，X1)，緩沖pH(6-8，X2)，緩沖液體積(50-100 mL，X3)，包括從姜的根莖液體提取得到的蛋白水解酶，通過(guò)響應(yīng)面方法研究牛奶凝乳現(xiàn)象。二次模型應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們得到了平均酶活性及其描述方程。將姜的根莖在76 mL，pH為7的緩沖液中均質(zhì)2.4 min，得到最大的凝乳值(

5、274 U/mL)。實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值無(wú)顯著不同(P>0.05)。這些結(jié)果作用于優(yōu)化提取過(guò)程，并且與奶酪工業(yè)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化植物凝乳劑有顯著相關(guān)性。
　　 (2)牛奶凝乳蛋白酶的純化。利用硫酸銨分離、離子交換和排阻作用色譜技術(shù)，姜的根莖34.9％復(fù)原。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定純化蛋白酶的分子質(zhì)量為36 kDa，pI值為4.3。最終該酶被純化約10.2倍。它是一種碳水化合物含量為3％的糖蛋白。這種純化酶在pH值5.5，溫度60℃表現(xiàn)出最大

6、的活性。其蛋白酶活性被碘代乙酰胺、E-64、PCMB、Hg2+和Cu2+強(qiáng)烈抑制。N-terminal序列分類(lèi)研究表明，抑制酶是半胱氨酸蛋白酶的一種。孤立酶的斷裂能力高于αs-酪蛋白，β-酪蛋白和k-酪蛋白緊隨其后。從先前報(bào)導(dǎo)的姜蛋白酶可知，不同的純化酶，分子量、pI值、碳水化合物含量、N-terminal序列各不相同。這些結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)純化的蛋白酶有潛在的能力作為皺胃酶的替代品應(yīng)用在乳品行業(yè)。
　　 (3)用植物來(lái)源的姜蛋白酶

7、和木瓜蛋白酶來(lái)研究對(duì)牛乳凝乳的影響。用比濁法來(lái)評(píng)估和比較用植源凝乳酶和小牛皺胃酶處理過(guò)的樣品的凝乳能力的不同。通過(guò)對(duì)合成奶酪脫水收縮量和感官評(píng)價(jià)的研究，發(fā)現(xiàn)小牛皺胃酶和姜蛋白酶牛奶的濁度都呈現(xiàn)三個(gè)不同發(fā)展階段的增長(zhǎng)。姜蛋白酶和木瓜蛋白酶與小牛皺胃酶相比凝膠時(shí)間短，但是凝膠結(jié)束需要較長(zhǎng)時(shí)間。這個(gè)從姜蛋白酶獲得的凝乳酶有較高產(chǎn)量。除了味道和苦澀，整體感覺(jué)，在凝乳酶中特性沒(méi)有表現(xiàn)顯著不同。
　　 (4)對(duì)凝乳劑的類(lèi)型，包括小牛皺胃酶(

8、GP)或姜蛋白酶(CR)在奶酪形成的整個(gè)成熟過(guò)程中的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明在奶酪的生產(chǎn)中使用小牛皺胃酶更利于蛋白質(zhì)的水解，在成熟60天后pH為4.6時(shí)，水溶性氮(WSN)、非蛋白氮(NPN)、氨基氮(NH3N)和氨基酸氮(AAN)的含量分別達(dá)到29.19％、9.86％、0.43％和0.59％，相比較使用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪WSN、NPN、NH3N和AAN的量分別為18.23％、8.64％、0.46％和0.73％。使用小牛皺胃酶生產(chǎn)的奶酪

9、降解得到α-酪蛋白、β-酪蛋白和γ-酪蛋白的量均高于使用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪。但是，在利用姜蛋白酶生產(chǎn)的奶酪成熟過(guò)程中，前體α-酪蛋白更易于降解，而且在整個(gè)的生產(chǎn)過(guò)程中疏水肽、親水肽以及二者的比例也明顯高于小牛皺胃酶生產(chǎn)的奶酪，這些結(jié)果將進(jìn)一步通過(guò)組成分分析(PCA)結(jié)果證實(shí)。
　　 (5)對(duì)用牛奶制成的Peshawari乳酪物化、微生物和感官特性進(jìn)行檢測(cè)，討論了姜蛋白酶和小牛皺胃酶對(duì)于乳酪品質(zhì)的影響。對(duì)于大多數(shù)的理化參數(shù)(脂肪、

10、蛋白質(zhì)、酸度、pH)，主要的微生物種群(總菌群，腸桿菌，乳酸菌，霉菌和酵母菌)進(jìn)行了研究，用不同的凝乳劑制成的乳酪呈現(xiàn)不顯著(P>0.05)差異。然而，用姜蛋白酶制成的奶酪和小牛皺胃酶相比，水分的顯著性呈現(xiàn)更低水平(P<0.05)，水溶性氮(SN)呈現(xiàn)高水平(P<0.05)。用姜蛋白酶制備的Peshawari奶酪，主要的感官屬性(外觀、質(zhì)感、氣味)均顯著提高(P<0.05)。重要的是，用姜蛋白酶制成的Peshawari奶酪沒(méi)有苦澀口感。