外源NO對(duì)桃果實(shí)線粒體親環(huán)素D的調(diào)控作用.pdf

1、線粒體是細(xì)胞合成ATP和氧化磷酸化的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的機(jī)體活動(dòng)提供能量。此外，線粒體還參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信息傳遞等過(guò)程。線粒體具有雙層膜結(jié)構(gòu)，正常的線粒體跨膜電位是線粒體行使生理功能的先決條件，是保持機(jī)體生理所必需的。ATP合酶這一供能機(jī)制發(fā)生障礙必將導(dǎo)致細(xì)胞細(xì)胞的線粒體跨膜電位降低，從而引起細(xì)胞一系列變化。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是線粒體上的一個(gè)特殊孔道，被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。親環(huán)蛋白 D（CyPD）被認(rèn)為是該孔道組成成分之一

2、，參與由線粒體通透性性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放引起的細(xì)胞凋亡。MPTP確切的分子結(jié)構(gòu)尚不明確，在維持線粒體和細(xì)胞穩(wěn)定中是否發(fā)揮正常的生理作用，是否僅在病理情況下出現(xiàn)，仍存在一定程度的爭(zhēng)議。NO作為一種生物活性物質(zhì)，可以在線粒體中產(chǎn)生，低濃度NO具有抗氧化作用，能夠調(diào)控線粒體中氧的消耗和活性氧的生成。NO處理可以延長(zhǎng)果實(shí)貯藏時(shí)間、保持果實(shí)品質(zhì)。探究NO處理果蔬線粒體通透性相關(guān)的指標(biāo)變化和NO對(duì)CyPD調(diào)控鮮有報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PC

3、R技術(shù)、RACE技術(shù)和蛋白表達(dá)技術(shù)體系對(duì)肥城桃果實(shí)CyPD蛋白進(jìn)行基因克隆及原核表達(dá)，并對(duì)CyPD蛋白和ANT蛋白進(jìn)行酵母雙雜檢驗(yàn)。以不同處理（5、15和30μmol L-1 NO、5μmol L-1 c-PTIO、去離子水）肥城桃為材料，檢測(cè)其線粒體膜通透性相關(guān)指標(biāo)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肥城桃CyPD基因全長(zhǎng)663 bp，編碼氨基酸部分為615 bp，CyPD蛋白由204個(gè)氨基酸組成。桃果實(shí)CyPD蛋白與蘋(píng)果該蛋白在進(jìn)化關(guān)系上較為

4、親密。CyPD蛋白可以進(jìn)行硝基化和谷胱甘肽化反應(yīng)。CyPD蛋白和ANT蛋白酵母雙雜互檢實(shí)驗(yàn)表明這兩種蛋白膜外部分并未發(fā)生相互作用。NO處理對(duì)CyPD基因拷貝數(shù)的下降有促進(jìn)作用，表明NO可能通過(guò)影響CyPD基因拷貝數(shù)而間接參與MPTP的調(diào)控。與對(duì)照（Control）相比，NO處理肥城桃果實(shí)減少了線粒體細(xì)胞色素C含量，清除NO則增加了細(xì)胞色素C的含量。NO處理能夠提高桃果實(shí)貯藏期線粒體ATP合酶活性，其中15μmol L-1 NO處理效果最

5、好。隨著桃果實(shí)貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理桃果實(shí)線粒體膜通透性均出現(xiàn)不同程度的增加，NO處理與Control相比能夠顯著提高線粒體膜抗性，其中5μmol L-1 NO處理桃果實(shí)線粒體在整個(gè)貯藏時(shí)期內(nèi)均維持在較低水平。NO處理能夠增強(qiáng)桃果實(shí)線粒體膜對(duì)脅迫或應(yīng)激信號(hào)的抵抗能力，而清除NO會(huì)起到相反作用。加入釕紅后，不同處理桃果實(shí)線粒體熒光強(qiáng)度均出現(xiàn)下降，其中15μmol L-1 NO處理下降值最大，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NO處理桃果實(shí)線粒體會(huì)對(duì)鈣離子