環(huán)親素A對(duì)泡沫細(xì)胞功能影響的初步研究.pdf

1、目的：
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)是一種以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎、關(guān)節(jié)損傷和骨破壞為特征的全身系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制和病因尚不清楚。多項(xiàng)研究表明，RA患者的病死率較普通人增高約70％左右，多半原因是心血管疾病所導(dǎo)致，而其中動(dòng)脈粥樣硬化的快速發(fā)展在RA患者心血管疾病所導(dǎo)致的死亡原因中占據(jù)首位。以往的研究證實(shí)，多種炎性介質(zhì)、促炎因子及炎細(xì)胞參與了RA患者的慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化的一系列

2、代謝功能紊亂，從而加速了RA患者動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。
　　細(xì)胞環(huán)親素A（CyclophilinA，CypA）是大量存在于細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)蛋白，免疫親環(huán)素家族成員，是免疫抑制劑環(huán)孢素A（cyclosporinA，CsA）的結(jié)合蛋白，具有肽脯氨酰順?lè)词疆悩?gòu)酶作用參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)紊亂、促進(jìn)炎癥反應(yīng)、蛋白折疊、蛋白活化等多種功能，如RA、自身免疫性疾病、腫瘤等。除了在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能之外，CypA同時(shí)也作為一種分泌性蛋白分子在心血管

3、疾病的生理及病理發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用，如血管狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化以及大動(dòng)脈血管瘤等。CD147分子，又稱(chēng)為基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（extracellularmatrixmetaloproteinaseinducer，EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族，CypA的受體之一。以往的研究表明，CypA可以通過(guò)與靶細(xì)胞膜分子CD147相結(jié)合促進(jìn)RA滑膜炎細(xì)胞中MMP-2、-9的表達(dá)及活性增強(qiáng)，從而進(jìn)一步加重對(duì)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解、破壞。<

4、br>　　新近文獻(xiàn)報(bào)道血小板與CD34+祖細(xì)胞共孵育可以分化出泡沫細(xì)胞模型，CD34+祖細(xì)胞在分化成泡沫細(xì)胞的過(guò)程中CD147的表達(dá)水平上調(diào)，那么CypA是否可以與泡沫細(xì)胞高表達(dá)的CD147相互作用調(diào)控泡沫細(xì)胞的形成及分化過(guò)程來(lái)誘導(dǎo)活化MMP的分泌從而加速了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展呢？因此本課題擬在本實(shí)驗(yàn)室先前研究CD147在RA相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索CypA調(diào)控泡沫細(xì)胞的形成及分化過(guò)程加速了RA相關(guān)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展這一病

5、理過(guò)程。
　　方法:
　　1.建立THP-1單核來(lái)源泡沫細(xì)胞模型
　　將THP-1單核細(xì)胞用PMA刺激分化為單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞后,再以氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）作用分化成功的THP-1單核來(lái)源巨噬細(xì)胞48h,建立泡沫細(xì)胞模型，并通過(guò)油紅“O”脂質(zhì)染色法鑒定單核來(lái)源的泡沫細(xì)胞。
　　2．CypA對(duì)泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中黏附力的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度CypA作用前后THP-1單核來(lái)源泡沫細(xì)胞分

6、化過(guò)程中其細(xì)胞表面CD54(ICAM-1)和CD147的表達(dá)變化。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)比較不同濃度CypA和作用前后單核來(lái)源泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中黏附能力的變化；同時(shí)用CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb等分別進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，分析CD147是否參與CypA對(duì)泡沫細(xì)胞細(xì)胞黏附力的影響。
　　3.CypA對(duì)泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中MMP-2、-9的表達(dá)活性和侵襲能力的影響
　　不同濃度CypA刺激單核來(lái)源泡沫細(xì)胞，收集細(xì)胞及細(xì)胞培

7、養(yǎng)上清，采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、RT-PCR、明膠酶譜法觀(guān)察檢測(cè)泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中侵襲力的變化、MMP-2、-9mRNA及蛋白分泌水平的變化；同時(shí)用CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb等分別進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn)，分析CD147是否參與CypA對(duì)泡沫細(xì)胞MMPs表達(dá)及侵襲能力的作用。
　　結(jié)果：
　　1．成功建立THP-1單核來(lái)源泡沫細(xì)胞模型
　　光鏡下觀(guān)察對(duì)照組細(xì)胞(THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞)內(nèi)無(wú)紅染顆粒,而處理組

8、（THP-1來(lái)源的泡沫細(xì)胞）細(xì)胞體積增大,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多的紅染顆粒,顯示細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分增加，油紅“O”特殊染色陽(yáng)性，符合泡沫細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征，證明成功建立了THP-1來(lái)源的泡沫細(xì)胞模型。
　　2．CypA增強(qiáng)泡沫細(xì)胞的黏附力及其拮抗劑的抑制作用
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示THP-1單核來(lái)源泡沫細(xì)胞分化過(guò)程中其細(xì)胞膜表面CD54(ICAM-1)和CD147的表達(dá)均較分化前的巨噬細(xì)胞和未分化的單核細(xì)胞均顯著增高（P<0.

9、05）；經(jīng)CypA作用后可以進(jìn)一步增強(qiáng)泡沫細(xì)胞膜表面CD54(ICAM-1)分子的表達(dá)(P<0.05)。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示單核來(lái)源的泡沫細(xì)胞的黏附率較分化前的單核、巨噬細(xì)胞的黏附率均顯著增高(P<0.05)；經(jīng)CypA處理亦可以顯著增強(qiáng)單核來(lái)源泡沫細(xì)胞的黏附力（P<0.05）；而針對(duì)CypA的拮抗劑CsA、抗CypA抗體c7b8f10和HAb18mAb對(duì)單核來(lái)源泡沫細(xì)胞黏附力均有不同程度的抑制作用，同時(shí)也抑制了CypA對(duì)黏附率的上調(diào)

10、作用（P<0.05）。
　　3.CypA增強(qiáng)泡沫細(xì)胞表達(dá)MMP-2、-9和侵襲力及其拮抗劑的抑制作用
　　明膠酶譜和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示THP-1單核株來(lái)源的泡沫細(xì)胞分泌MMP-2，9蛋白和mRNA的表達(dá)水平都分別顯著高于分化前的巨噬細(xì)胞和未分化的的THP-1單核細(xì)胞(P<0.05)；經(jīng)不同濃度CypA后，單核來(lái)源泡沫細(xì)胞MMP-2，9的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；而針對(duì)CypA的拮抗劑CsA、抗CypA抗體c7b