仙鶴草黃酮及三萜組分多途徑干預(yù)Ⅱ型糖尿病的研究.pdf

1、根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)邦組織調(diào)查統(tǒng)計(jì)表明:II型糖尿病(T2DM)已經(jīng)成為了繼癌癥,心血管病后的危害人類健康、剝奪人類生命的第三大殺手。以“整體醫(yī)學(xué)”理念為指導(dǎo),綜合考慮T2DM及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的各種因素,尋找高效、低毒、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用的藥物有望成為防治T2DM及其并發(fā)癥的新策略。本課題以中醫(yī)傳統(tǒng)用于T2DM治療的中藥—仙鶴草為研究對(duì)象,基于其治療T2DM物質(zhì)基礎(chǔ)不明、作用機(jī)制不清楚的現(xiàn)實(shí),借鑒“中藥藥效組分”和“整體醫(yī)學(xué)”理念,綜合采用

2、天然藥物化學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等多學(xué)科的理論和技術(shù),以氧化應(yīng)激、а-葡萄糖苷酶活性和胰島素抵抗為靶點(diǎn),研究闡明仙鶴草干預(yù)T2DM的藥效組分的物質(zhì)基礎(chǔ),并初步探討其活性組分多途徑干預(yù)T2DM的藥理活性和作用機(jī)制。主要工作和結(jié)論如下:⑴采用現(xiàn)代分離技術(shù),建立仙鶴草的黃酮組分(FC)和三萜組分(TC)的分離制備工藝,利用分光光度法測(cè)定兩個(gè)活性組分的總黃酮和總?cè)坪?采用HPLC技術(shù),對(duì)其活性組分的主要物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行定位和表征。①采

3、用硅膠柱和LH20分離柱,建立了仙鶴草的FC和TC的分離制備工藝;②分光光度法測(cè)得仙鶴草的FC總黃酮含量為316.53±6.37mg/g,TC的總?cè)坪繛?15.97±5.15mg/g;③通過(guò)HPLC對(duì)其活性組分進(jìn)行物質(zhì)表征定位,發(fā)現(xiàn)FC中含有槲皮苷、銀椴苷、杜荊苷、異杜荊苷、金絲桃苷、木犀草素、蘆丁、芹菜素、山奈酚、花旗松素、兒茶素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷等;TC中含有熊果酸、4-羥基熊果酸、科羅羧酸、馬斯里酸和齊墩果酸等;④對(duì)

4、FC和TC中的單體的種類和各自的相對(duì)百分含量與仙鶴草95％和50%乙醇提取物進(jìn)行了比較,結(jié)果表明該分離制備工藝基本能比較完整的保留仙鶴草全草提取物中的黃酮類和三萜類物質(zhì)群。⑵采用DPPH體系、H2O2-Fe2+體系、ABTs+·體系和β-胡蘿卜素/亞油酸體系,系統(tǒng)研究了仙鶴草FC和TC的清除自由和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的活性。①FC對(duì)DPPH、 OH和ABTs+·均具有較強(qiáng)的清除活性,其半數(shù)清除濃度(EC50)分別為:7.73、3.64和5.90

5、μg/mL;TC的自由基清除活性較弱,EC50分別為:＞100、35.18和＞100μg/mL;陽(yáng)性對(duì)照對(duì)此3種自由基的EC50分別為:7.69、3.14和2.54μg/mL;②F C和TC具有一定的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的活性,二者抑制β-胡蘿卜素淬滅的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為41.77和98.54μg/mL,活性小于陽(yáng)性對(duì)照BHT(IC50=1.84μg/mL),差異顯著(p＜0.05)。⑶對(duì)FC和TC活性組分抑制а-葡萄糖苷酶活性和其

6、酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。①FC和TC具有較強(qiáng)的а-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC50分別為3.67和8.72μg/mL;②仙鶴草FC和TC配比為4:1、1:4和1:1時(shí),配比組分均具有較好的а-葡萄糖苷酶抑制活性,其IC50分別為3.93、10.39和9.39μg/mL,仙鶴草中FC和TC的自然配比(4:1)具有更強(qiáng)的抑制а-葡萄糖苷酶的活性;③酶動(dòng)力學(xué)研究表明FC為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,TC為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,可以初步驗(yàn)證,仙鶴草FC和TC對(duì)а-葡萄糖

7、苷酶的活性具有協(xié)同增效的抑制作用。⑷以3T3-L1為模型,通過(guò)對(duì)細(xì)胞分化形態(tài),三酰甘油含量和影響分化相關(guān)的因子的基因表達(dá)的檢測(cè),探討了FC和TC兩個(gè)活性組分對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響。①?gòu)腇C和TC對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的形態(tài)和三酰甘油含量的累積的影響可以看出,TC比FC處理下生成的脂滴體積較大,且具有更強(qiáng)的促進(jìn)胞內(nèi)三酰甘油的累積的作用;②仙鶴草FC和TC的兩個(gè)活性組分在一定的濃度范圍內(nèi)具有明顯的促進(jìn)PPARγ、Cebp-а、SREBP-1激活表

8、達(dá),且FC具有與陽(yáng)性對(duì)照相當(dāng)?shù)妮^強(qiáng)地促進(jìn)PPARγ表達(dá)的活性;FC和TC對(duì)于下游的促進(jìn)脂肪過(guò)度累積和大脂滴形成的調(diào)控基因(AP2)和游離脂肪酸形成的調(diào)控基因(LPL)具有比陽(yáng)性對(duì)照更好的抑制調(diào)控作用;而對(duì)于GLUT4和Adiponectin的表達(dá)在濃度達(dá)到一定的范圍時(shí),具有很好的增效作用。因此,可以初步的推論仙鶴草的活性組分是通過(guò)選擇性地調(diào)控和激活PPARγ的表達(dá),這有別于傳統(tǒng)的激動(dòng)劑的完全激活的形式,在對(duì)外周胰島素敏感性進(jìn)行改善的同時(shí)