仙鶴草抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ)及構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、隨著自由基醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)氧化應(yīng)激在疾病發(fā)生、發(fā)展中作用的認(rèn)識(shí)也不斷深入。研究表明氧化應(yīng)激與癌癥、心腦血管疾病、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。尋找優(yōu)異的抗氧化劑，特別是天然抗氧化劑應(yīng)用于氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防與治療已成為臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域的重要課題之一。本課題以薔薇科多年生草本植物龍牙草(Agrimonia pilosa Ledeb.)的全草——仙鶴草為研究對(duì)象，利用天然藥物化學(xué)、計(jì)算化學(xué)、藥理學(xué)和現(xiàn)代儀器分析等多

2、學(xué)科的理論及方法，重點(diǎn)圍繞仙鶴草提取物及其各極性部位的抗氧化活性、活性部位的化學(xué)成分、單體的抗氧化活性及其清除自由基的構(gòu)效關(guān)系和抗氧化活性物質(zhì)特征指紋圖譜進(jìn)行了研究。論文研究獲得如下主要結(jié)論：
　　 ①以清除DPPH·活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得了仙鶴草抗氧化活性物質(zhì)群的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為54.68％、液料比為21.78、提取溫度為74.6℃、提取時(shí)間2h，提取次數(shù)3次。
　　 ②采用DPPH·體系、核黃素光照體系、

3、H2O2-Fe2+體系、β-胡蘿卜素/亞油酸體系、紫外線-H2O2-pBR322 DNA體系和BSA-Glu體系，研究了仙鶴草粗提物及各極性部位的清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)非酶糖基化的活性，結(jié)果表明：(1)仙鶴草粗提物具有顯著的清除自由基的活性，對(duì)DPPH·、O2-·和·OH的半數(shù)清除濃度(EC50)分別為：6.45、8.94和103.16μg/mL；較強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化的活性，抑制β-胡蘿卜素淬滅的半數(shù)抑制濃度

4、(IC50)為10.13μg/mL；較強(qiáng)的抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化的活性，在1.0mg/mL時(shí)，其對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的抑制率達(dá)到了70.33％；一定的抑制DNA氧化損傷斷裂的活性(圖3.6)。(2)仙鶴草提取物抗氧化的主要活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。二者的清除DPPH·、O2-·和·OH的EC50分別為4.88、7.29、63.96μg/mL和5.64、7.66、81.31μg/mL；二者抑制β-胡蘿卜素淬滅的IC50分別為5.42、4

5、.97μg/mL；乙酸乙酯部位表現(xiàn)了顯著的抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化的作用，在1.0mg/mL時(shí)，其對(duì)蛋白質(zhì)糖基化的抑制率達(dá)到了84.41％；對(duì)DNA氧化損傷的保護(hù)作用也以乙酸乙酯部位最強(qiáng)。(3)酚類化合物是仙鶴草中的主要抗氧化活性物質(zhì)群。清除2-·和·OH的活性、抗脂質(zhì)過(guò)氧化活性及抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化活性均與總酚含量顯著相關(guān)(p＜0.05)。
　　 ③以分離技術(shù)和現(xiàn)代波譜技術(shù)等研究手段，從乙酸乙酯部位分離鑒定了23個(gè)化合物，包括14

6、個(gè)黃酮類化合物：槲皮素、兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷、花旗松素、山奈酚、異牡荊苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、銀椴苷、芹菜素和牡荊苷；2個(gè)異香豆素化合物：仙鶴草內(nèi)酯和仙鶴草內(nèi)酯-6-O-葡萄糖苷；7個(gè)三萜類化合物：β-胡蘿卜苷、熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸、馬斯里酸、萎陵菜酸和1β，2β，3β，19α-四羥基-12-烯-28-酸。其中花旗松素、牡荊苷、異牡荊苷、熊果酸、齊墩果酸、科羅索酸和馬斯里酸為首

7、次從仙鶴草中分離得到。
　　 ④清除DPPH·的活性研究表明黃酮類化合物為仙鶴草抗氧化活性的主要活性成分。14種黃酮類化合物清除DPPH·活性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋洪纹に兀緝翰杷兀窘鸾z桃苷＞蘆?。鹃纹ぼ眨灸鞠菟兀灸鹃夭菟?7-O-葡萄糖苷＞花旗松素＞山奈酚＞異牡荊苷＞山奈酚-3-O-葡萄糖苷、銀椴苷、芹菜素、牡荊苷。其中槲皮素、兒茶素、金絲桃苷、蘆丁、槲皮苷、木犀草素、木樨草素-7-O-葡萄糖苷對(duì)DPPH·的半數(shù)清除濃度小于10μM，

8、活性優(yōu)于抗壞血酸和2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)，差異顯著(p＜0.05)。首次發(fā)現(xiàn)異牡荊苷清除自由基活性顯著優(yōu)于其苷元芹菜素，即芹菜素C-6成苷可顯著提高清除自由基活性，這可能是提高黃酮類化合物抗氧化活性的又一可選擇的結(jié)構(gòu)修飾途徑。
　　 ⑤采用AM1半經(jīng)驗(yàn)和密度泛函計(jì)算相結(jié)合以及多層Oniom計(jì)算的量子化學(xué)方法，研究了14個(gè)黃酮類化合物的O-H解離焓(BDE)和自由基自旋密度，對(duì)黃酮類化合物清除自由基活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行了

9、量子化學(xué)理論探討。結(jié)果表明：(1)3-OH、B環(huán)上的鄰羥基、2,3-雙鍵和4-羰基的存在可以使自由基的自旋密度分布更加均衡，降低B環(huán)的O-H的BDE，提高化合物清除自由基的活性；(2)黃酮醇3-OH的糖苷化可增大B環(huán)和C環(huán)的夾角，導(dǎo)致自旋密度不均衡性的增加，升高B環(huán)的O-H的BDE，降低化合物清除自由基的活性；(3)黃酮A環(huán)C-6成苷可導(dǎo)致其自由基的自旋密度分布更加均勻，提高自由基的穩(wěn)定性；而C-8成苷可使B環(huán)和C環(huán)的夾角增大，導(dǎo)致離域