中國(guó)小麥花葉病毒侵染性克隆構(gòu)建及運(yùn)動(dòng)蛋白的功能分析.pdf

1、中國(guó)小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)為真菌傳桿狀病毒屬(genus Furovirus)的一個(gè)新成員，通常與大麥黃花葉病毒屬(genus Bymovirus)的小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus，WYMV)復(fù)合侵染，引起我國(guó)山東膠東冬小麥地區(qū)發(fā)生嚴(yán)重的田間病害。該病毒由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis L.)傳播，此菌在土壤中廣泛分布，且抗

2、逆性強(qiáng)，很難用化學(xué)藥劑防治，而在生產(chǎn)上抗CWMV的小麥品種缺乏，急需進(jìn)行抗病新種質(zhì)的創(chuàng)新。研究CWMV致病機(jī)理，不僅為抗病種質(zhì)資源的創(chuàng)制提供理論依據(jù)，并且豐富相關(guān)植物病毒的分子生物學(xué)知識(shí)。本研究主要內(nèi)容分兩部分:(1)構(gòu)建CWMV侵染性cDNA克隆;(2)對(duì)CWMV RNA1編碼的37K蛋白功能進(jìn)行研究和分析。
　　 根據(jù)已報(bào)道的CWMV RNA1和RNA2序列(登錄號(hào):AJ271838和AJ271839)分段設(shè)計(jì)序列引物，擴(kuò)增

3、了CWMV RNA1和RNA2的cDNA片段并進(jìn)行了拼接，對(duì)拼接產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆，獲得CWMV全長(zhǎng)cDNA克隆。以獲得的克隆質(zhì)粒為模板，線性化后，利用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物摩擦接種煙草和小麥，17℃培養(yǎng)，Western blot未能檢測(cè)到接種的煙草或小麥植株中CWMV外殼蛋白的表達(dá)。體外轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體后，17℃培養(yǎng)，在原生質(zhì)體內(nèi)可檢測(cè)到微量外殼蛋白的積累，表明此侵染性克隆具有活性，但效率較差，有待于摸索條件

4、進(jìn)一步提高其侵染活力。
　　 利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)CWMV RNA1編碼的37K基因進(jìn)行融合表達(dá)，得到預(yù)期大小的蛋白條帶。對(duì)37K包涵體蛋白進(jìn)行了純化，并免疫蘇格蘭大白兔制備了抗血清。ELISA檢測(cè)感病小麥葉片表明，此抗血清可以用于檢測(cè)感病的小麥和在煙草葉片中此蛋白的表達(dá)。
　　 瞬時(shí)表達(dá)運(yùn)動(dòng)缺陷型PVX載體(含p19)與構(gòu)建的CWMV編碼的CP、19KCRP、37K3個(gè)基因共浸潤(rùn)農(nóng)桿菌

5、，共聚焦和長(zhǎng)波紫外觀察只有37K能夠互補(bǔ)運(yùn)動(dòng)缺陷型PVX的運(yùn)動(dòng)功能，并在多個(gè)細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。含35S∶37K載體的農(nóng)桿菌與含35S∶eGFP農(nóng)桿菌高倍稀釋后共浸潤(rùn)本氏煙，發(fā)現(xiàn)37K能與胞間連絲(PD)作用增大胞間連絲孔徑限制(SEL)。將eGFP融合37K的N端和C端，高倍稀釋后，在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)。通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)37K主要定位在細(xì)胞壁邊緣，并形成不規(guī)則的運(yùn)動(dòng)聚集體顆粒，與TMV30K和胞間連絲定位蛋白(PDLP1a)分別共

6、定位發(fā)現(xiàn)37K定位在PD，質(zhì)壁分離后細(xì)胞邊緣的綠色熒光斑點(diǎn)始終留在細(xì)胞壁，而熒光聚集體顆粒在收縮細(xì)胞膜的牽引下做無(wú)規(guī)則移動(dòng)，可能與細(xì)胞內(nèi)膜有關(guān)，通過(guò)提取表達(dá)37K的細(xì)胞膜蛋白，進(jìn)而證實(shí)聚集體為37K細(xì)胞內(nèi)膜蛋白。這些實(shí)驗(yàn)表明，37K蛋白的定位與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜相關(guān)。37K融合蛋白(37K∶eGFP或eGFP∶37K)用布雷菲爾德菌素A(BFA)、微絲抑制劑(LatB)化學(xué)試劑處理，并與無(wú)標(biāo)簽的Sar1[H74L]以及帶尾巴的Ⅷ-1和Ⅺ-F

7、兩種肌球蛋白共表達(dá)表明，37K利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的分泌途徑和肌動(dòng)球蛋白動(dòng)力系統(tǒng)定位和運(yùn)輸?shù)桨g連絲。
　　 CWMV37K為包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白，根據(jù)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列設(shè)計(jì)缺失掉不同的跨膜區(qū)、非跨膜區(qū)以及點(diǎn)突變跨膜區(qū)等一系列突變體，結(jié)果表明37K包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的N端和C端對(duì)于互補(bǔ)運(yùn)動(dòng)缺陷型PVX進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)都是必須的。缺失任何一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)е聠适Оg連絲定位的能力，最終定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。而同時(shí)缺失兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)

8、域時(shí)，導(dǎo)致蛋白改變了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位。同時(shí)具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的突變體dC1能進(jìn)行胞間運(yùn)動(dòng)，擴(kuò)大PD SEL并能形成聚集體顆粒，表明完整的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)?7K蛋白的運(yùn)動(dòng)功能起著重要作用。
　　 進(jìn)而克隆了本氏煙果膠甲基酯酶(Pectin methylesterase，PME)，通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)和酵母雙雜交兩種方法對(duì)CWMV37K與PME的互作進(jìn)行了驗(yàn)證，明確兩者主要互作在細(xì)胞壁上。利用雙分子熒光互補(bǔ)方法，確定37K與PME的互作區(qū)