無細胞體系中胞壁酸合成途徑的構建及反義寡核苷酸抑制作用的研究.pdf

1、無細胞蛋白表達體系是一種體外合成蛋白質的開放系統(tǒng)，沒有細胞結構的限制，因此，與傳統(tǒng)體內蛋白表達系統(tǒng)相比，在蛋白質合成方面具有許多優(yōu)勢，如反應條件容易控制，操作簡單方便，容易實現(xiàn)高通量反應等。本文主要開展無細胞體系同時合成多種細胞壁肽聚糖合成酶并用于體外重建胞壁酸合成途徑的研究，探索無細胞蛋白質合成技術在體外合成生物學和無細胞生物學方面的應用潛力。
　　細胞壁肽聚糖合成途徑的相關酶蛋白在大多數(shù)細菌中保守度高，是開發(fā)廣譜新抗生素的重要

2、靶點。然而，傳統(tǒng)胞壁酸合成途徑存在于細胞質內，難以用傳統(tǒng)方法進行抑制劑的高效篩選。本論文在體外無細胞蛋白合成體系中，通過添加胞壁酸合成酶基因PCR產物作為線性模板，實現(xiàn)了6種關鍵酶基因(MurA-MurF)的可溶性共表達。進一步加入MurA-MurF所需的各種底物后，采用HPLC檢控每一步酶反應的中間產物，并使用HPLC-ESI-MS測定各個中間產物的性質，確證了這一多酶反應終產物（UDP-MurNAc-L-Ala-γ-D-Glu-me

3、so-2，6-diaminopimeloyl-D-Ala-D-Ala）。這一研究工作不僅實現(xiàn)了胞壁酸合成途徑的體外重構，而且將多靶點抗生素高通量篩選方法從體內向體外方向轉變。
　　反義寡核苷酸在細菌的代謝調控和生物醫(yī)藥領域都有重要的應用價值。本課題利用體外構建的胞壁酸合成途徑，開展高效篩選能有效抑制MurA-MurF表達的反義寡核苷酸的研究。首先通過計算機輔助識別目標mRNA結構的模擬，針對以上6種目標酶蛋白基因共設計27條反義寡

4、核苷酸，然后檢測各種反義寡核苷酸對目標蛋白表達的抑制作用。結果表明，在設計的27條反義寡核苷酸中，有10條寡核苷酸對各自目標基因表達的抑制作用達到了90％以上。然后重點研究了反義寡核苷酸A281和B139分別對MurA和MurB的抑制劑量效應。結果表明，當目標基因線性模板濃度為10 ng/μL條件下，40μM反義寡核苷酸能夠完全抑制MurA或MurB的表達，從而在體外實現(xiàn)對胞壁酸合成途徑的阻斷。這一工作進一步佐證了這一復雜多酶催化途徑在

5、無細胞體系中的成功重建，而且這些篩選出的反義寡核苷酸具有成為新抗菌藥物的潛力。
　　無細胞體系的合成效率和相應試劑盒的工具性是制約無細胞蛋白質合成技術廣泛應用的關鍵性抑制因素。在實驗室長期的無細胞體系制備基礎上，通過在無細胞制備宿主中表達肌酸激酶和T7 RNA聚合酶，能夠簡化無細胞體系的制備和降低成本，可應用于無細胞蛋白質合成試劑盒研制。同時構建了無細胞連續(xù)交換連續(xù)反應的表達系統(tǒng)，并制作了基于24孔板的CECF無細胞反應器，能夠用