美拉德反應(yīng)對魚類小清蛋白免疫學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、魚類是常見的過敏食物，我國作為魚類生產(chǎn)及消費大國，由魚類引起的食物過敏問題不容忽視。小清蛋白（Parvalbumin，PV）是魚類主要過敏原。隨著對魚類過敏原性質(zhì)研究的深入，通過加工處理消減魚類過敏原的致敏性，開發(fā)低致敏性魚類制品將具有重要的意義。美拉德反應(yīng)是食品加工中廣泛存在的反應(yīng)，不僅促進食品風(fēng)味，改善食品色澤，對食物過敏原的免疫活性也有一定的影響。本研究擬建立并優(yōu)化魚類主要過敏原 PV美拉德反應(yīng)的條件，并分析美拉德反應(yīng)對 PV的免

2、疫學(xué)性質(zhì)、消化穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)的影響，以期為開發(fā)低致敏性魚類食品提供一定的理論依據(jù)。
　　利用構(gòu)建的重組PV（Recombinant Parvalbumin，rPV）表達(dá)菌株[BL21/pET-28a-PV]，表達(dá)純化出 rPV；以糖種類、糖添加量、反應(yīng)時間為變量，以反應(yīng)產(chǎn)物的聚合情況及褐變度為監(jiān)測指標(biāo)，優(yōu)化了rPV的美拉德反應(yīng)條件：rPV:葡萄糖/木糖（w/w）=1:8，100°C條件下反應(yīng)100 min。對rPV美拉德產(chǎn)物性質(zhì)的分

3、析結(jié)果顯示，美拉德反應(yīng)后rPV的含糖量、熒光強度均明顯增加；Dot blotting分析表明，美拉德反應(yīng)降低了rPV的IgG結(jié)合活性。采用QE-MS/MS分析表明，在該反應(yīng)條件下rPV的第55、84、88、97、108位賴氨酸殘基發(fā)生了糖化修飾，其中第88、97、108位賴氨酸殘基位于IgE結(jié)合表位區(qū)域，連接在賴氨酸殘基上的糖鏈可能對表位產(chǎn)生直接的封閉效應(yīng)，從而降低了小清蛋白的致敏性。圓二色譜分析結(jié)果表明，美拉德反應(yīng)后rPV無規(guī)則卷曲的

4、百分含量降低；ANS疏水性熒光探針檢測結(jié)果顯示美拉德反應(yīng)后rPV疏水性增加；掃描電鏡結(jié)果顯示，糖化后的rPV互相交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這些蛋白結(jié)構(gòu)的改變可能也是影響rPV免疫活性的重要原因之一。
　　利用rPV優(yōu)化的美拉德反應(yīng)條件，進一步研究糖化對天然小清蛋白免疫活性及結(jié)構(gòu)的影響。以廈門產(chǎn)海洋魚類灰星鯊（Mustelus griseus）為研究對象，利用硫酸銨鹽析及連續(xù)柱層析（DEAE-Sepharose、Sephacryl S-20

5、0 HR）從灰星鯊魚肉中分離純化得到分子量分別為14 kDa和12 kDa兩個亞型的小清蛋白（SPVI，SPVII）。分別對其在蛋白:葡萄糖（w/w）=1:8，100°C條件下反應(yīng)100 min進行美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)后SPVI、SPVII的IgG結(jié)合活性均降低，消化穩(wěn)定性增加，二級結(jié)構(gòu)部分喪失，疏水性增加。進一步采用RBL-2H3細(xì)胞模型評價美拉德反應(yīng)對 SPVs致敏性的影響，通過測定脫顆粒情況以及組胺、IL-4、TNF-α的分泌量

6、變化，證實美拉德反應(yīng)可降低SPVs的免疫活性。
　　在此基礎(chǔ)上，利用美拉德反應(yīng)結(jié)合高壓處理制備低致敏性鯊魚魚松。Dot blotting分析表明，與對照組相比，采用高壓結(jié)合美拉德反應(yīng)制備的鯊魚魚松IgG結(jié)合活性基本消失。采用Balb/c小鼠致敏模型證實，高壓處理結(jié)合美拉德反應(yīng)制備的鯊魚魚松與對照組相比，可以減輕小鼠過敏癥狀、減緩直腸溫度下降并抑制Th2脾臟淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌，表明采用高壓結(jié)合美拉德反應(yīng)制備的鯊魚魚松具有較低的致敏